馬皰疹病毒1型染料法熒光定量PCR試劑盒

Equine Herpesvirus 1 (EHV-1)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

皰疹病毒（herpes virus）是一群有包膜的 DNA 病毒，生物學(xué)特性相似，歸類為 皰疹病毒科（Herpesviridae）。其感染宿主廣泛，主要侵害皮膚、黏膜以及神經(jīng)組 織，嚴(yán)重影響著人及其他動(dòng)物的健康。馬可能感染多種皰疹病毒。常見的與感冒病 毒相似，易致呼吸困難。而金溪馬術(shù)中心發(fā)現(xiàn)的是罕見卻嚴(yán)重的馬皰疹病毒 1 型 （EHV-1）。它會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可引起步態(tài)不穩(wěn)、無法排尿、尾部下垂及無法 站立。年齡偏大、易感的馬匹可能無法存活。馬皰疹病毒 1 型(EHV-1)經(jīng)感染甚至重 復(fù)感染馬后產(chǎn)生的免疫力是短期的,且馬在一生中可以受到幾次感染。因此靈敏快捷的 診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本公司產(chǎn)品開發(fā)馬皰疹病毒 1 型染料法熒光定量 PCR 試 劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒 DNA 模板。

2. 引物根據(jù)馬皰疹病毒 1 型專一區(qū)設(shè)計(jì)，特異性高。

3. 熒光定量 PCR 檢測(cè)，比常規(guī) PCR 更加靈敏。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

馬皰疹病毒1型染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽性對(duì)照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提 供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備 陽性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定 性分析，則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào)，其余樣品不變）。 以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

12. 設(shè)定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 32。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 32 則為陰性，如果小 于或等于 30 則為陽性。如果在 30-32 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 32 則為陰性，如果小于 30，則為陽性。