馬鼻肺炎病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

Equine Rhinopneumonitis Virus(ERV)

產(chǎn)品及特點

馬鼻肺炎病毒(Equine Rhinopneumonitis Virus，ERV)會引起馬鼻肺炎， 又名馬病毒性流產(chǎn)，是馬的一種急性發(fā)熱性傳染病，在自然條件下只感染馬屬動 物。病馬和康復后的帶毒馬是傳染源，主要經(jīng)呼吸道傳染，消化道及交配也可傳 染，可呈地方性流行，多發(fā)生于秋冬和早春。妊娠母馬感染本病時，易發(fā)生流產(chǎn)； 幼駒發(fā)病初期高熱，體溫高達 39.5-41℃，可持續(xù) 2-7 天，同時可見鼻粘膜充血 并流出漿液性鼻液，頜下淋巴結腫大，食欲稍減，體溫下降后可恢復正常，若發(fā) 病后調教或勞役過度，易引起細菌繼發(fā)感染，發(fā)生肺炎和腸炎等，造成死亡。該 病毒容易給馬場養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟損失，因此馬鼻肺炎病毒的快速準確鑒定對 該病的預防和檢疫有著重要作用，本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基 礎開發(fā)的專門檢測馬鼻肺炎病毒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)馬鼻肺炎病毒高度保守區(qū)設計，不會跟其他病毒 DNA 發(fā)生交叉反應。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。 

馬鼻肺炎病毒探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。

使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用 水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后后加）：

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值 為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該 小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct 值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。