前病毒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒

HIV-1 Provirus HIV-1

產(chǎn)品及特點(diǎn)

人類(lèi)免疫缺陷病毒１型（HIV-１）患者血漿中病毒 RNA 水平一直以來(lái)是評(píng) 判抗病毒治療效果或預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)。但是，經(jīng)抗病毒治療后血漿 HIV- １RNA 已達(dá)到基線水平感染者的血液、精液或淋巴結(jié)中仍可以檢測(cè)到 HIV-１原 病毒 DNA 的存在，構(gòu)成病毒儲(chǔ)藏庫(kù)，對(duì)清除 HIV-１病毒構(gòu)成嚴(yán)重阻礙。所以在 病毒載量已經(jīng)檢測(cè)不到的情況下，HIV-１原病毒 DNA 水平可以作為除 CD4+Ｔ 細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量之外的另一標(biāo)志物。本產(chǎn)品就是以探針?lè)晒舛?PCR 技 術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)檢測(cè) HIV-1 前病毒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù) HIV-1 前病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

前病毒探針?lè)晒舛縋CR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑  樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品，好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 陽(yáng)性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用 水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好 后后加）：

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值 為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小 于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。