血吸蟲通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Schistosoma spp.

產品及特點

血吸蟲通用(Schistosoma spp.) 會引起血吸蟲病，該病主要通過皮膚，黏膜與疫水接觸受染。患病后，侵襲期患者可有咳嗽、胸痛、偶見痰中帶血絲等癥狀，急性期臨床上常會出現(xiàn)發(fā)熱、痢疾樣大便且帶血和黏液、肝脾大、咳嗽、胸痛，血痰等癥狀，慢性期多因急性期未曾發(fā)現(xiàn)，未治療或治療不*，或多次少量重復感染等原因，逐漸發(fā)展而成，晚期病人極度消瘦，出現(xiàn)腹水、巨脾，腹壁靜脈怒張等晚期嚴重癥狀。感染該病對人體健康造成嚴重損害，因此快速檢測血吸蟲通用具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以染料法熒光定量PCR技術為基礎開發(fā)的專門檢測血吸蟲通用的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2.特異性高，引物是根據人血吸蟲通用高度保守區(qū)設計,不會擴增其他細菌和微生物。

3. 引物和擴增體系經過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產生環(huán)境污染。

6. 本產品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

血吸蟲通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、制備標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA段作為陽性對照。
1.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3.在7號管中加入5 μL 陽性對照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7.用自選方法純化樣品的DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。
8.如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的天凈沙DNA釋放劑試用裝。則按下面步驟操作：
9.配制溶液A工作液。以配制1mL工作液（足夠10個樣品）為例：在一干凈塑料管中加入10μL溶液A成分一，20μL溶液A成分二和970μL超純水，充分混合均勻即可。溶液A工作液可室溫放置，但在一周內用完，不要長期放置。一次檢測一個樣品需要100μL溶液A工作液，1mL工作液足夠10個樣品。如果待測樣品數量為其他數字，配制的溶液A工作液的體積需要做相應的調整。
10.在標記好的N+2個離心管中，加入1-5mg（半粒芝麻大?。┕腆w待測樣品或5μL液體待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入5μL陽性對照，在樣品制備陰性對照中加入5μL水。
11.在每個管中加入100 μL溶液A工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻。
12.95℃保溫10分鐘。
13.待冷卻到常溫后加入10μL溶液B并混勻得DNA釋放液。每個樣品得到的DNA釋放液足夠進行50-100次PCR。
三、設置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
14.如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。如果做2-3次重復，則反應設置數量相應增加2或3倍。
15.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

16.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR（具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量PCR反應參數

五、數據處理
17.設定60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽性。
18.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
19.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
五、電泳檢測
如果有必要電泳確認，可取10-20 μL PCR產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產物的大小為400 bp。