天花病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Variola Virus(VARV)

產(chǎn)品及特點

天花病毒(Variola Virus，VARV) 會引起天花，是一種烈性傳染病，感染天花病毒后的潛伏期平均約為12天，感染后的初期癥狀包括：高燒、疲累、頭疼、心跳加速及背痛。2-3天后，會有典型的天花紅疹明顯地分布在臉部、手臂和腿部。在發(fā)疹的初期，還會有淡紅色的塊狀面積伴隨疹子而出現(xiàn)。病灶在幾天之后開始化膿，直到第2個星期開始結痂。接下來的3-4周慢慢發(fā)展成疥癬，然后慢慢剝落。該病毒會對人體健康有較大影響，因此天花病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的天花病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2.根據(jù)天花病毒保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。

3.靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4.一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR。
6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

天花病毒染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 

一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽性對照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千 萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病 原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽 性對照。

2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋 的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原 液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此 稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加 上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取 決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。制備所得成為樣品 DNA。

9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼 容。

三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上 步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性 分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用 第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟， 定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個，其余不變。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢 后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

12.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

13.數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結合DNA時，大吸收光譜在471 nm，結合DNA時的大吸收光譜在500 nm，大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理
14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。