弧菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Vibrio spp.

產(chǎn)品及特點

弧菌（Vibrio spp.）是菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性菌?；【鷮購V泛分布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動物體內(nèi)。該菌引起的食物中毒經(jīng)烹飪不當?shù)暮．a(chǎn)品或鹽腌制品所傳播。常見的為海蟄、海魚、海蝦及各種貝類，因食物容器或砧板生熟不分污染本菌后，也可發(fā)生食物中毒。該菌常年均可發(fā)生，可從自限性腹瀉至中度霍亂樣病癥，有腹痛、腹瀉、嘔吐和低熱，糞便多為水樣，少數(shù)為血水樣，恢復(fù)較快，病后免疫力不強，可重復(fù)感染，該菌還可引起淺表創(chuàng)傷感染、敗血癥等，給人體健康帶來嚴重損害，因此弧菌檢測具有重要的意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測弧菌的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2.特異性高，引物是根據(jù)人弧菌高度保守區(qū)設(shè)計,不會擴增其他細菌。

3. 引物和擴增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無傳染性的 PCR 陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

弧菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、制備標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA段作為陽性對照。
1.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3.在7號管中加入5 μL 陽性對照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7.用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8.如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進行）
9.如果進行定量分析，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。如果做定性分析，則6個標準曲線樣品只選一個做（可以選4號，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。
10.在標記管中按下表加入各成分：

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
四、熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理
12.設(shè)定60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽性。
13.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
14.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。