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　　本文摘自和光純藥時(shí)報(bào)Vol.87 （2019年1月號(hào)），由FUJIFILM株式會(huì)社環(huán)境與品質(zhì)管理部安全性評(píng)估中心山本裕介教授、藤田正晴教授、笠原利彥教授以及勝岡尉浩教授共同執(zhí)筆。

 

◆前言

　　從動(dòng)物福利的觀點(diǎn)出發(fā)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)定正在世界范圍內(nèi)不斷推進(jìn)。從1993年開始，歐盟開始分階段實(shí)施化妝品成分的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)定，2013年之后，歐盟各國(guó)全面禁銷含有進(jìn)行過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的原料的化妝品^[1]。

　　在這樣的背景下，不使用動(dòng)物的安全性測(cè)試（動(dòng)物試驗(yàn)替代法）的開發(fā)迫在眉睫，皮膚刺激性、眼睛刺激性、皮膚腐蝕性、皮膚致敏性、光毒性等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代法作為獲認(rèn)可的方法，被列入經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）的測(cè)試指南（TG）中。2006年，日本修訂并實(shí)行動(dòng)物愛護(hù)管理法^[2]，此后，3R原則^※在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中得到了加強(qiáng)。

　　對(duì)此，日本也積極推動(dòng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代法的開發(fā)，替代眼睛刺激性測(cè)試的體外短時(shí)暴露試驗(yàn)^[3]（STE，Short Time Exposure in vitro test method）（OECD TG491）、替代皮膚致敏測(cè)試的細(xì)胞系活化試驗(yàn)^[4]（h-CLAT，human Cell Line Activation Test）（OECD TG442E ; ANNEX I）以及IL-8 Luc試驗(yàn)^[5]（IL-8 Luc assay，Interleukin-8 Reporter Gene Assay）（OECD TG442D ; Appendix IA）都被列入了測(cè)試指南中。

　　另外，日本還開始研發(fā)替代法需要用到的材料，使用3D培養(yǎng)皮膚模型的用于替代皮膚刺激性測(cè)試的重組人表皮試

驗(yàn)^[6]（Reconstructed Human Epidermis Test Method，OECD TG439）和使用3D培養(yǎng)角膜模型的用于替代眼睛刺激性測(cè)試的重組類似人角膜表皮試驗(yàn)^[7]（RhCE，Reconstructed Human Cornea-like Epithelium Test Method）（OECD TG492），都采用了Japan Tissue Engineering Co., Ltd.生產(chǎn)的皮膚和角膜模型。

　　除上述化妝品行業(yè)外，歐盟的《化學(xué)品的注冊(cè)、評(píng)估、授權(quán)及限制法規(guī)》——REACH法規(guī)在2016年6月也修訂了REACH附錄Ⅶ和Ⅷ，規(guī)定每年生產(chǎn)和進(jìn)口不超過10噸的物質(zhì)必須使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代法來作為皮膚腐蝕性、皮膚刺激性、眼睛刺激性和皮膚致敏測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試法。

　　本文將為大家介紹新開發(fā)的試替代皮膚致敏測(cè)試的氨基酸衍生物反應(yīng)法（ADRA，Amino acid Derivative Reactivity Assay）。

 

◆皮膚致敏的機(jī)制與替代法

　　皮膚致敏是一種由皮膚暴露在化學(xué)物質(zhì)下引起的過敏反應(yīng)。皮膚致敏性會(huì)使體內(nèi)的免疫系統(tǒng)將化學(xué)物質(zhì)記憶為異物，因此，當(dāng)皮膚再次暴露在化學(xué)物質(zhì)時(shí)就會(huì)表現(xiàn)出過度的反應(yīng)，引起紅斑（發(fā)紅）、水腫（腫脹）和水皰（水泡）等癥狀。另外，皮膚致敏性與皮膚刺激性的反應(yīng)不同，免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的癥狀。此外，由于反應(yīng)涉及到免疫系統(tǒng)，所以從皮膚暴露在致敏物質(zhì)中到癥狀的出現(xiàn)是一個(gè)復(fù)雜的過程。OECD定義了該過程中的四個(gè)關(guān)鍵事件：1.蛋白與致敏物質(zhì)的結(jié)合，2.角質(zhì)細(xì)胞的活化，3.樹突狀細(xì)胞的活化，4.T細(xì)胞的增殖^[8]。

　　目前，使用較為廣泛的in vivo（體內(nèi)）皮膚致敏測(cè)試法就是用小鼠進(jìn)行的局部淋巴結(jié)試驗(yàn)（LLNA，Local Lymph Node Assay），是以關(guān)鍵事件4為基礎(chǔ)的評(píng)估法。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代法收錄了6種以除關(guān)鍵事件4外的其他三個(gè)關(guān)鍵事件為基礎(chǔ)的測(cè)試法，包括以關(guān)鍵事件1為基礎(chǔ)的直接肽反應(yīng)試驗(yàn)^[9]（DPRA，Direct Peptide Reactivity Assay）（OECD TG442C），以關(guān)鍵事件2為基礎(chǔ)的ARE-Nrf2熒光素酶試驗(yàn)^[10]（ARE-Nrf2 luciferase test method，KeratinoSens™）（OECD TG442D ; Appendix IA）和ARE-Nrf2 Luciferase LuSens^[11]（OECD TG442D；Appendix IB），還有以關(guān)鍵事件3為基礎(chǔ)的h-CLAT^[4], U937皮膚致敏試驗(yàn)^[12]（U-SENS，U937 Skin Sensitization Test）（OECD TG442E；ANNEXⅡ）和 IL-8 Luc試驗(yàn)^[13]。

　　致敏物質(zhì)進(jìn)入人體后和蛋白結(jié)合，形成復(fù)合物，被免疫細(xì)胞之中的樹突狀細(xì)胞吸收后，該復(fù)合物被視為抗原（異物）。這種蛋白與致敏物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物的過程就是關(guān)鍵事件1，和2015年被收錄于TG的DPRA相同，筆者團(tuán)隊(duì)開發(fā)的ADRA也是一種利用過程來評(píng)價(jià)反應(yīng)性的測(cè)試法。

 

◆ADRA和DPRA的原理比較

　　蛋白與致敏物質(zhì)的結(jié)合，主要是通過蛋白中的巰基，以及半胱氨酸或賴氨酸的氨基的共價(jià)結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的^[13,14]。因此，DPRA使用含有半胱氨酸的肽和含有賴氨酸的肽，通過這兩種肽與待測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)性來評(píng)價(jià)致敏物質(zhì)與蛋白的結(jié)合性能^[15]。

 

圖1. NAC和NAL的結(jié)構(gòu)式

 

　　相比之下，ADRA運(yùn)用了在半胱氨酸和賴氨酸兩種氨基酸中引入了帶萘環(huán)的新型氨基酸衍生物，N-（2-（1-Naphthyl）acetyl）-L-cysteine（NAC）和α-N-（2-（1-Naphthyl）acetyl）-L-lysine（NAL）（圖1），通過測(cè)試它們與待測(cè)待測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)結(jié)果來評(píng)估致敏物質(zhì)與蛋白的結(jié)合性能^[14,15,16]。

　　測(cè)試步驟如下。首先，在96孔板上配制NAC、NAL和待測(cè)物質(zhì)以1:50的摩爾比混合的反應(yīng)溶液，在25℃中遮光孵育24小時(shí)。24小時(shí)后加入CF₃COOH（TFA）水溶液終止反應(yīng)，然后用HPLC檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)和未反應(yīng)的NAC、NAL的量，從而算出待測(cè)物質(zhì)的NAC、NAL的反應(yīng)性（圖2）。DPRA和ADRA一樣，在肽與測(cè)試物質(zhì)反應(yīng)24小時(shí)后，用HPLC定量未反應(yīng)的肽，以計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)性。

 

圖2. ADRA測(cè)試法的流程

 

　　與使用培養(yǎng)細(xì)胞或生物來源成分的體外（in vitro）測(cè)試不同，ADRA 和 DPRA只評(píng)價(jià)物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)（in chemico測(cè)試），是一種重復(fù)性好、精,確度高的簡(jiǎn)易測(cè)試法。

　　盡管基本原理和測(cè)試程序相同，但ADRA用NAC和NAL來替代了肽，所以ADRA在許多方面都優(yōu)于DPRA。

 

表1. ADRA與DPRA的比較表

			ADRA		DPRA
試劑	親核試劑	種類	NAC	NAL	含有半胱氨酸的肽	含有賴氨酸的肽
		在反應(yīng)溶液中的濃度	5 µM		500 µM
		抗氧化劑	0.2 µM EDTA	無需添加	無	無需添加
	待測(cè)物質(zhì)溶液	溶劑的種類	①水，②乙腈，③丙酮，④DMSO/乙腈		①乙腈，②水，③乙腈/水，④異丙醇，⑤丙酮，⑥丙酮/乙腈，⑦乙腈/ DMSO
		在反應(yīng)溶液中的濃度	0.25 mM		5 mM	25 mM
	緩沖液	種類	磷酸緩沖液		磷酸緩沖液	醋酸銨緩沖液
		pH	8.0	10.2	7.5	10.2
反應(yīng)	反應(yīng)容器		96孔板		HPLC用瓶
	親核試劑所需量		約0.3 µg/孔		約400 µg/瓶
	待測(cè)物質(zhì)所需量 （分子量按200計(jì)算）		0.01 mg/孔		0.2 mg/瓶	1 mg/瓶
	反應(yīng)液總量		200 µL		1000 µL
	溫度		25 ℃
	時(shí)間		24小時(shí)
終止反應(yīng)	終止液	溶液	TFA溶液		無
		添加量	50 µL
HPLC檢測(cè)	檢測(cè)波長(zhǎng)		281 nm		220 nm
	分析時(shí)間		20分鐘/試劑		20分鐘/試劑

EDTA：乙二胺四乙酸

TFA溶液：2.5%（v/v）CF₃COOH水溶液

 

　　在DPRA中，反應(yīng)溶液中待測(cè)物質(zhì)的濃度高達(dá)5~20 mM，待測(cè)物質(zhì)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)沉淀的現(xiàn)象，并且需要在220 nm短波長(zhǎng)下定量這兩種肽，因此會(huì)出現(xiàn)與待測(cè)物質(zhì)來源的峰重疊的情況（共出峰），從而無法正確地評(píng)估致敏性。

　　另一方面，由于NAC和NAL具都有萘環(huán)，所以它們可以在281 nm處定量，比DPRA長(zhǎng)約60 nm。所以幾乎不與待測(cè)物質(zhì)來源的峰共出峰。另外，NAC和NAL在HPLC中的檢測(cè)靈敏度高，反應(yīng)溶液中待測(cè)物質(zhì)可以在0.2 mM的濃度（濃度為DPRA的1/100）下進(jìn)行測(cè)試，基本上不會(huì)析出待測(cè)物質(zhì)。

　　除此之外，DPRA中含半胱氨酸的肽的氧化和二聚化會(huì)降低定量的準(zhǔn)確度，但作者發(fā)現(xiàn)，金屬離子會(huì)參與巰基的氧化，所以在ADRA中向NAC的反應(yīng)溶液加入極微量的EDTA，能改善NAC的穩(wěn)定性^[17]。

　　DPRA中含半胱氨酸肽的二聚體在反應(yīng)溶液中的析出可能會(huì)影響HPLC的檢測(cè)，而且不能對(duì)它的二聚化進(jìn)行定量。而在ADRA中，可以通過HPLC定量而不會(huì)析出NAC二聚體，即使NAC發(fā)生氧化，也能容易判斷出對(duì)測(cè)試系統(tǒng)的影響。

　　除了上述要點(diǎn)之外，ADRA還能在HPLC的檢測(cè)過程中添加終止液來抑制反應(yīng)的進(jìn)行，獲得比DPRA誤差更少且更穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，與在HPLC瓶中配制反應(yīng)溶液的DPRA不同，ADRA使用96孔板和多通道移液器，可實(shí)現(xiàn)高通量，是一種通用性好、操作性*的高精,確度測(cè)試法。

 

◆ADRA的致敏評(píng)估能力

　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代法需要進(jìn)行與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相同的安全性評(píng)估。為了確認(rèn)ADRA和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一樣能對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行皮膚致敏評(píng)估，作者用建立DPRA測(cè)試法時(shí)使用過的82種物質(zhì)對(duì)LLNA進(jìn)行預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度評(píng)估。結(jié)果顯示ADRA的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度高達(dá)87%^[18]。

　　綜上，ADRA是一種非常有效的測(cè)試法，自2016年以來，作者一直致力于將ADRA收錄在OECD測(cè)試指南中。2017年，四所研究機(jī)構(gòu)參與了評(píng)估ADRA重復(fù)性與有效性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，而該實(shí)驗(yàn)在相同儀器與不同儀器間也獲得了非常高的可重復(fù)性。目前，作者正根據(jù)此結(jié)果申請(qǐng)將ADRA收錄于測(cè)試指南中。

 

◆今后的展望

　　如本文所述，ADRA在很多方面都優(yōu)于DPRA，與其他體外替代法相比，無需使用培養(yǎng)細(xì)胞的ADRA還具有眾多優(yōu)點(diǎn)，如無需使用特殊設(shè)施、設(shè)備及無菌操作等技術(shù)，測(cè)試周期短、價(jià)格低、重復(fù)性良好等。

　　歐盟禁止化妝品原料進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后，化妝品行業(yè)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代法的需求不斷提高；另外，在REACH法規(guī)修訂后，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代法也被納入到除化妝品原料外的一般化學(xué)品的安全性評(píng)估中。今后，ADRA有望在化妝品行業(yè)以外等更廣泛的領(lǐng)域中得到進(jìn)一步應(yīng)用。

 

◆關(guān)鍵詞

3R原則

指"Replacement：替換為不使用動(dòng)物的方法"、""Reduction：減少動(dòng)物數(shù)量的使用"和"Refinement：減輕實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物帶來的痛苦"的3點(diǎn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則。

 

◆參考文獻(xiàn)

[1]	EU化粧品指令 (第7次改正) European Commission : "DIRECTIVE 2003/15/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 27 February 2003，amending Council Directive 76/768/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products", Official J. European Union, L66/26 (2003).
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