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再生醫(yī)學(xué)之細(xì)胞外囊泡療法的新型工具箱
閱讀：1283 發(fā)布時(shí)間：2021-1-22
使用PS親和法分離的MSC來(lái)源細(xì)胞外囊泡具有較高的抗炎和抗纖維化作用
細(xì)胞外囊泡（EVs）是由細(xì)胞釋放的微小脂質(zhì)雙分子層顆粒。如今，細(xì)胞外囊泡由于可以傳遞生物活性脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，被*為是細(xì)胞間通訊的重要信使。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）來(lái)源的細(xì)胞外囊泡，正成為未來(lái)再生醫(yī)學(xué)中頗具前景的治療策略。本文將介紹一種細(xì)胞外囊泡分離技術(shù)——PS親和法，以及目前為止在再生醫(yī)學(xué)中發(fā)現(xiàn)的實(shí)用性。
◆細(xì)胞外囊泡（EVs）
細(xì)胞外囊泡，包括外泌體和微囊泡，是由細(xì)胞釋放的小于1,000 nm的脂質(zhì)雙層顆粒，同時(shí)帶有標(biāo)記蛋白CD9、CD63和CD811）。細(xì)胞外囊泡包含蛋白質(zhì)、DNA、RNA和脂質(zhì)等細(xì)胞成分，被認(rèn)為是通過(guò)轉(zhuǎn)移這些成分來(lái)進(jìn)行細(xì)胞間的交流。
◆MSC來(lái)源細(xì)胞外囊泡
MSC是來(lái)源于間充質(zhì)的干細(xì)胞，可以分化為脂肪、骨骼和軟骨。MSC可以從骨髓、脂肪組織或臍帶建立，使其成為有前景的未來(lái)再生醫(yī)學(xué)的來(lái)源。已知MSC具有某些旁分泌效應(yīng)，包括免疫抑制、抗炎和抗纖維化。近的報(bào)告顯示，這些影響是由MSCs釋放的細(xì)胞外囊泡（EVs）引起的3），這也是MSC來(lái)源細(xì)胞外囊泡（EVs）療法受到關(guān)注的原因。
◆新型細(xì)胞外囊泡（EVs）分離技術(shù)-PS親和法-
分離細(xì)胞外囊泡包括以下幾種方法：已經(jīng)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期應(yīng)用的超速離心、密度梯度離心及針對(duì)表面抗原的抗體親和法4）。但是以上方法存在諸如回收率低、純度低、不能收集完整囊泡、再現(xiàn)性差等問(wèn)題。 對(duì)此，富士膠片和光與金澤大學(xué)的華山教授合作共同開(kāi)發(fā)了一種新的PS親和法，該方法可捕獲表達(dá)于細(xì)胞外囊泡表面的磷脂酰絲氨酸（PS）5）。PS親和法利用的是與PS鈣依賴性結(jié)合的Tim4蛋白。Tim4蛋白雖能與PS牢固結(jié)合，但也可由Ca2+螯合劑（如EDTA）釋放。利用該特性，可開(kāi)發(fā)出比傳統(tǒng)方法的回收效率、純度、收集完整囊泡和可重復(fù)性更佳的細(xì)胞外囊泡分離方法（圖1）。
圖1
A）通過(guò)PS親和法進(jìn)行的細(xì)胞外囊泡步驟
B）通過(guò)PS親和法或UC分離EVs的透射電子顯微鏡圖。箭頭表示EVs。
◆PS親和法可分離具有高活性的MSC來(lái)源細(xì)胞外囊泡
接下來(lái)要介紹的是我們近在分離MSC來(lái)源細(xì)胞外囊泡中發(fā)現(xiàn)到的PS親和法的價(jià)值。首先，通過(guò)PS親和法或超速離心法（UC）從骨髓來(lái)源的MSC條件培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞外囊泡。然后，通過(guò)PS ELISA比較每種分離方法的回收效率，一種PS親和技術(shù)的細(xì)胞外囊泡定量法（圖2A）。通過(guò)檢測(cè)CD9、CD63或CD81分析細(xì)胞外囊泡的定量。結(jié)果顯示，UC回收率為40％，而PS親和法回收率為80％以上（圖2B）。
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圖2
A）PS ELISA的原理
這是一種對(duì)細(xì)胞外囊泡進(jìn)行定量的原創(chuàng)性技術(shù)，通過(guò)固定化Tim4蛋白和檢測(cè)抗體分別實(shí)現(xiàn)捕獲細(xì)胞外囊泡和檢測(cè)細(xì)胞外囊泡的表面抗原。
B）通過(guò)PS親和法或UC法分離的MSC來(lái)源細(xì)胞外囊泡的定量檢測(cè)
檢測(cè)抗體是抗CD9抗體、抗CD63抗體或抗CD81抗體。該圖顯示的是相對(duì)值，其中培養(yǎng)基的細(xì)胞外囊泡數(shù)量為100％。
PS ELISA法：PS CaptureTM外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP）（298-80601；包括抗CD63抗體），抗CD9抗體（019-27953），抗CD81抗體（011-28111）。
此外，我們比較了每種方法分離出來(lái)的MSC來(lái)源細(xì)胞外囊泡活性并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的抗炎作用和正常人胎兒肺二倍體成纖維細(xì)胞（TIG3細(xì)胞）的抗纖維化作用。結(jié)果表明，通過(guò)PS親和法分離的MSC來(lái)源細(xì)胞外囊泡比通過(guò)UC分離的細(xì)胞外囊泡具有更高的活性（圖3、4）。
圖3. MSC來(lái)源的細(xì)胞外囊泡對(duì)LPS誘發(fā)的炎癥的作用
用LPS刺激由PBMC分離出的單核細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)炎癥，然后添加由各方法分離出的4.5×108粒子/ mL細(xì)胞外囊泡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSC來(lái)源的細(xì)胞外囊泡抑制了TNFα和IL-6基因表達(dá)的增強(qiáng)以及TGFβ基因表達(dá)的降低。PS分離的細(xì)胞外囊泡比UC分離的細(xì)胞外囊泡更具抑制作用。
圖4. MSC來(lái)源的細(xì)胞外囊泡對(duì)纖維化的影響
用TGFβ刺激TIG3細(xì)胞并誘導(dǎo)纖維化相關(guān)基因增強(qiáng)表達(dá)，隨后添加由各方法分離的1×109 粒子/ mL的細(xì)胞外囊泡。MSC來(lái)源的細(xì)胞外囊泡抑制了膠原III、αSMA和膠原V基因的升高，PS分離的細(xì)胞外囊泡比UC分離的細(xì)胞外囊泡更具抑制作用。
這個(gè)結(jié)果顯示，PS親合法能夠以高回收率分離MSC來(lái)源的細(xì)胞外囊泡，同時(shí)保持細(xì)胞外囊泡的高活性。換言之，它揭示了傳統(tǒng)方法除回收率低外，還因超速離心的物理?yè)p傷引致細(xì)胞外囊泡的功能的損害。我們的PS親和法有望成為未來(lái)細(xì)胞外囊泡療法的創(chuàng)新技術(shù)。
◆結(jié)論
綜上所述，盡管基于細(xì)胞外囊泡的療法在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域正備受關(guān)注，但經(jīng)典方法（例如超速離心）仍被廣泛用于分離細(xì)胞外囊泡6）。PS親和法是一種理想的方法，可解決傳統(tǒng)方法帶來(lái)的問(wèn)題，例如回收效率低及降低細(xì)胞外囊泡的活性等。該試劑盒具有出色的回收效率、純度、收集完整細(xì)胞外囊泡的能力及可重復(fù)性。不難設(shè)想，未來(lái)的再生醫(yī)學(xué)將需要優(yōu)化的細(xì)胞外囊泡分離方法，希望本文的PS親和法將是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的強(qiáng)大工具。
◆產(chǎn)品列表
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
299-77603 | MagCapture™外泌體分離試劑盒PS | 2 tests |
293-77601 | 10 tests | |
297-79201 | PS Capture™外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD） | 96 tests |
298-80601 | PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP） | 96 tests |
◆視頻
2020年ISEV研討會(huì)：如何使用 MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS
復(fù)制鏈接觀看視頻：labchem.fujifilm-wako.com.cn/resources/show/56.html
[用于分離和檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡的PS親和力的特性]。
復(fù)制鏈接觀看視頻：labchem-wako.fujifilm.com/us/wako-blog/videos/2020-07-08%2009-40-45.mp4
◆產(chǎn)品資料
復(fù)制鏈接下載產(chǎn)品彩頁(yè)（labchem.fujifilm-wako.com.cn/pdf/show/120.html），或向當(dāng)?shù)卮砩趟饕堎|(zhì)版本。
◆參考文獻(xiàn)
1. | Colombo et al., Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of Extracellular vesicles and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol, 30 : 255-289 （2014）.
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2. | Mathieu et al., Specificities of secretion and uptake of Extracellular vesicles and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol, 21（1） : 9-17 （2019）
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3. | Phinney and Pittenger, Concise Review : MSC-Derived Extracellular vesicles for Cell-Free Therapy. Stem Cells, 35（4） : 851-858 （2017）
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4. | Thery et al., Isolation and characterization of Extracellular vesicles from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol Chapter 3, Unit 3 22 （2006）
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5. | Nakai et al., A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci Rep 6 : 33935 （2016）
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6. | Fujita et al., Clinical Application of Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Inflammatory Lung Diseases. J Clin Med 7（10） : 355 （2018） |