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富士膠片和光純藥株式會(huì)社 生物技術(shù)中心 福地大樹

◆前言

內(nèi)毒素，是存在革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的一種脂多糖（Lipopolysaccharide），僅需微量進(jìn)入血液便可引發(fā)發(fā)熱癥狀，大量存在時(shí)則表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒性，甚至導(dǎo)致內(nèi)毒素休克和死亡^1）。鑒于革蘭氏陰性菌在環(huán)境中的廣泛分布及其可能混入生產(chǎn)過(guò)程，加之內(nèi)毒素的耐熱性和不易滅活特性，對(duì)注射劑和醫(yī)療器械實(shí)施內(nèi)毒素污染管理顯得尤為重要。近年來(lái)，隨著再生醫(yī)療、疫苗、抗體及核酸藥物等相關(guān)產(chǎn)品的蓬勃發(fā)展，內(nèi)毒素管理在這些產(chǎn)品中的重要性也日益凸顯。

目前，內(nèi)毒素的檢測(cè)主要依賴于利用鱟血細(xì)胞提取物凝固系統(tǒng)的鱟試劑（LAL/TAL）。然而，為了保護(hù)鱟資源、確保鱟試劑穩(wěn)定供應(yīng)、減少產(chǎn)品批間差異及提高檢測(cè)穩(wěn)定性，各鱟試劑廠家正積極使用人工原料生產(chǎn)的基因重組蛋白來(lái)開發(fā)重組鱟試劑（rLAL）。

◆內(nèi)毒素測(cè)試法的檢測(cè)原理

內(nèi)毒素測(cè)試法是使用由鱟血細(xì)胞成分制備的鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)或定量的方法。鱟的血細(xì)胞提取物成分中存在使內(nèi)毒素凝固的反應(yīng)體系，這種凝固反應(yīng)基于多個(gè)絲氨酸蛋白酶前體依次活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)（圖1）。內(nèi)毒素激活鱟血細(xì)胞提取物中含有的C因子，隨后活化C因子激活B因子。然后，活化B因子再激活凝固酶前體，活化的凝固酶通過(guò)水解底物凝固蛋白原，將其轉(zhuǎn)化為凝固素，形成不溶性凝膠并凝固。在鱟血細(xì)胞提取成分中還存以G因子為起點(diǎn)，與β-葡聚糖發(fā)生反應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)也會(huì)引起凝固反應(yīng)。為實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素的特異性檢測(cè)，需去除G因子或抑制以G因子為起點(diǎn)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

圖1 由內(nèi)毒素、β-葡聚糖引起的凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)

◆使用基因重組蛋白的重組鱟試劑（rLAL）試劑

目前已商業(yè)化的rLAL試劑有兩種，一種是重組C因子試劑（rFC），僅使用參與內(nèi)毒素級(jí)聯(lián)反應(yīng)三因子中的C因子；另一種是重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR），使用與LAL試劑相同的3因子（C因子、B因子、凝固酶前體）。與rCR相比，rFC的單次檢測(cè)成本低，但是靈敏度較差，需要使用熒光底物的熒光檢測(cè)和檢測(cè)儀。而rCR的靈敏度更高，可發(fā)生顯色發(fā)應(yīng)，因此和天然鱟試劑一樣可使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。近年來(lái)，有報(bào)告稱B因子對(duì)于內(nèi)毒素的特異性有著重要作用^2）3），因此使用含有C因子、B因子和凝固酶前體的rCR來(lái)檢測(cè)內(nèi)毒素具有重要意義。FUJIFILM Wako于2022年推出了rCR試劑PYROSTAR™ Neo。

◆PYROSTAR™ Neo的特點(diǎn)與改進(jìn)

PYROSTAR™ Neo是一款高靈敏度重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR），可定量檢測(cè)低至 0.001 EU/mL的內(nèi)毒素，且操作簡(jiǎn)單，只需將凍干粉末溶解于試驗(yàn)用水即可，溶解后也具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。另一方面，由各研究機(jī)構(gòu)和鱟試劑廠家組成的重組鱟試劑共同研究小組在該產(chǎn)品上市后實(shí)施的評(píng)估結(jié)果表明，PYROSTAR™ Neo在部分水樣中對(duì)天然內(nèi)毒素的反應(yīng)性低于天然鱟試劑⁴⁾。由于生產(chǎn)用水占內(nèi)毒素檢測(cè)的比例較高，因此從安全角度來(lái)看，對(duì)天然內(nèi)毒素的反應(yīng)性低有待改進(jìn)。針對(duì)這一問(wèn)題，F(xiàn)UJIFILM Wako于2024 年 6月推出了PYROSTAR™ Neo+ 的改良版——PYROSTAR™ Neo＋。

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◆PYROSTAR™ Neo＋

重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）PYROSTAR™ Neo＋，不僅繼承了前代PYROSTAR™ Neo的高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、溶解后穩(wěn)定性優(yōu)異的特點(diǎn)，還提高了對(duì)天然內(nèi)毒素的反應(yīng)性（PYROSTAR™ Neo存在的問(wèn)題）。通過(guò)對(duì)從日本全國(guó)各地采集的自來(lái)水樣品中的天然內(nèi)毒素進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)試，結(jié)果顯示，與PYROSTAR™ Neo相比，PYROSTAR™ Neo＋的反應(yīng)性更高，且與天然鱟試劑（ES-F）具有相同的反應(yīng)性（圖2）。由于生產(chǎn)用水占內(nèi)毒素檢測(cè)的比例較高，從安全角度考慮，PYROSTAR™ Neo＋對(duì)水中內(nèi)毒素的良好反應(yīng)性具有重要意義。此外，PYROSTAR™ Neo＋另一大特點(diǎn)是在藥物檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠，并可檢測(cè)多種藥物。

圖2 對(duì)水中天然內(nèi)毒素反應(yīng)性的對(duì)比結(jié)果

◆結(jié)語(yǔ)

目前，天然鱟試劑仍是內(nèi)毒素檢測(cè)的主流試劑，而利用人工原料合成基因重組蛋白的重組鱟試劑的歷史較短，有待進(jìn)一步普及。國(guó)際上主流藥典對(duì)使用重組鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)的監(jiān)管情況如下：

· 2021年，歐洲藥典正式收錄了利用熒光法的基因重組C因子試劑（rFC）。

· 第十八版（最新版）日本藥典的參考信息中記載了“使用基因重組蛋白作為內(nèi)毒素測(cè)試法和檢測(cè)試劑的替代法"。

此外，美國(guó)藥典將于2025年5月新增允許使用重組鱟試劑（rCR、rFC）進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)的章節(jié)，因此重組鱟試劑備受關(guān)注。這些發(fā)展可能會(huì)加速歐洲藥典追加收錄rCR，以及日本藥典對(duì)重組鱟試劑（rCR、rFC）的正式收錄。目前有關(guān)鱟試劑和重組鱟試劑的比較正在不斷推進(jìn)^4）5），今后可能會(huì)持續(xù)推進(jìn)重組鱟試劑的使用，但需滿足制藥企業(yè)等用戶的具體需求以推動(dòng)重組鱟試劑的實(shí)際應(yīng)用，從而實(shí)現(xiàn)用戶利益與環(huán)境保護(hù)（包括鱟類生物保護(hù)）的平衡。?

參考文獻(xiàn)

1）棚元憲一：國(guó)立醫(yī)薬品食品衛(wèi)生研究所報(bào)告, 126, 19 (2008).

2）Kobayashi,Y. et al. : J. Biol. Chem., 290, 19379 (2015).

3）Tsuchiya. M. : Int. J. Dev. Res. 10, 36751 (2020).

4）菊池裕 他：醫(yī)薬品醫(yī)療機(jī)器レギュラトリーサイエンス, 54 (4), 341 (2023).

5）菊池裕 他：醫(yī)薬品醫(yī)療機(jī)器レギュラトリーサイエンス, 48 (4), 252 (2017).

◆產(chǎn)品列表

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