偶氮聚合物引發(fā)劑
一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，生物學(xué)家們一直夢(mèng)想著能夠透過(guò)器官甚至整個(gè)機(jī)體，親眼看到細(xì)胞連接和精細(xì)結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在隨著組織透明化技術(shù)的完善，這一夢(mèng)想終于成為了現(xiàn)實(shí)。

偶氮聚合物引發(fā)劑

 

一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，生物學(xué)家們一直夢(mèng)想著能夠透過(guò)器官甚至整個(gè)機(jī)體，親眼看到細(xì)胞連接和精細(xì)結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在隨著組織透明化技術(shù)的完善，這一夢(mèng)想終于成為了現(xiàn)實(shí)。

 

◆原理

VA-044 作為組織透明化技術(shù)中起關(guān)鍵作用的水溶性偶氮引發(fā)劑，普遍適用于高分子合成的水溶液聚合與乳液聚合。在CLARITY 方法中，VA-044 作為引發(fā)劑，催化丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和PFA 形成水凝膠。

2013 年3 月，斯坦福大學(xué)的Karl Deisseroth 博士的團(tuán)隊(duì)在自然雜志上發(fā)表了Structural and molecularinterrogation of intact biological systems 的論文，文中介紹了制備組織的方法CLARITY。該方法是將組織浸透在水凝膠單體溶液中中，經(jīng)電泳使組織呈現(xiàn)透明。這種水溶膠—組織雜交的方式可以維持組織的原有結(jié)構(gòu)，使生物分子結(jié)合到水凝膠的網(wǎng)孔上。重要的是脂類(lèi)不會(huì)結(jié)合到水凝膠上，因而可以通過(guò)這種方式將脂類(lèi)有效去除。通過(guò)這種方法制備的組織樣品可用于后期的影像實(shí)驗(yàn)，免疫染色，原位雜交等實(shí)驗(yàn)。

CLARITY可用于熒光蛋白質(zhì)和抗體的免疫染色，可作為解析腦神經(jīng)回路的有效工具。VA-044是論文實(shí)驗(yàn)步驟中透明化工程的使用試劑。

 

◆特點(diǎn)• 優(yōu)勢(shì)

●操作簡(jiǎn)單，固定蛋白后只需進(jìn)行電泳；

●可保持組織、器官和全身結(jié)構(gòu)的完整性；

● 可進(jìn)行原位雜交和免疫組化實(shí)驗(yàn)，可進(jìn)行多輪染色和脫色步驟；

 

◆案例•應(yīng)用

 

Clarity 介紹

 

PARS 介紹

2014 年7 月，加州理工學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在細(xì)胞雜志上發(fā)表論文Single-Cell Phenotyping within TransparentIntact Tissue through Whole-Body Clearing，將CLARITY 技術(shù)推進(jìn)到一個(gè)新的高度——全身組織透明化技術(shù)，稱(chēng)為PARS。這種技術(shù)將透明劑持續(xù)泵入動(dòng)物的循環(huán)系統(tǒng)從而進(jìn)入各個(gè)組織，或者通過(guò)腦脊液管道泵入大腦，再去除脂質(zhì)，使器官和生物體被高分子滲透而呈現(xiàn)透明，并可用熒光抗體分析和揭示具有完整連接性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和三維細(xì)胞排列。

圖A. PARS 建立的小鼠透明化腸，并用凝集素 亞甲基藍(lán)、DAPI 進(jìn)行免疫標(biāo)記后成像  并獲得三種免疫標(biāo)記的疊加圖	圖B. PARS 建立的小鼠透明化腎臟并用抗微管蛋白抗體 和DRAQ5 進(jìn)行免疫標(biāo)記后成像，并獲得兩種免疫 標(biāo)記的疊加圖

 

CLARITY處理的小鼠腦

 

 

CLARITY處理的小鼠大腦成像

 

CLARITY處理的Thy1-YFP（H Line）小鼠大腦的熒光觀察
（A）從大腦皮質(zhì)到海馬的3-D觀察圖像
（B）大腦皮層Ⅴ層的錐體細(xì)胞的樹(shù)突圖像
拍攝條件：雙光子   使用設(shè)備：Olympus FV1000直立顯微鏡，25倍浸液物鏡

 

CLARITY+抗體處理的小鼠大腦成像

 

CLARITY處理后，用Iba1抗體染色Thy1-YFP（H線）小鼠大腦的熒光觀察
（A）在大腦皮質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞的3-D觀察圖像
（B）從表面層觀察皮質(zhì)Ⅰ層的圖像
拍攝條件：?jiǎn)喂庾?span style="font-family:微軟雅黑,microsoft yahei">   使用設(shè)備：Olympus FV1000直立顯微鏡，25倍浸液物鏡

 

 

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)	產(chǎn)品規(guī)格	產(chǎn)品等級(jí)
223-02112	VA-044	25 g	細(xì)胞生物學(xué)
225-02111	VA-044	100 g	細(xì)胞生物學(xué)
227-02115	VA-044	500 g	細(xì)胞生物學(xué)
019-19741	小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體（免疫組化）	50μg	免疫化學(xué)用

 

偶氮聚合物引發(fā)劑

◆相關(guān)資料

VA-044(聚合物引發(fā)劑）	CLARITY電泳儀器	CLARITY_Protocol
文獻(xiàn)驗(yàn)證可與Wako透明化試劑配合使用的抗體列表	組織透明化試劑系列

 

◆相關(guān)產(chǎn)品

制造商	產(chǎn)品編號(hào)	中文名稱(chēng)	包裝
NIHON EIDO	631-26271	脂質(zhì)去除用電泳槽	一臺(tái)

 

CLARITY 步驟

 

水凝膠單體溶液組成

 

●VA-044············1 g
●40％的丙烯酰胺······40 mL
●2％雙丙烯酰胺·····10 mL
●10×PBS···········40 mL
●16％多聚甲醛·····100 mL

●皂素···········200 mL

●水··············210 mL

 

電泳緩沖液

●硼酸...123.66 g
●SDS····400 g
●NaOH···調(diào)制至pH8.5

●水·····定容至10 L

●Electrophoresis Chamber For Lipid Extraction

 

循環(huán)泵

●GPU-1,GPU-2（AS版）

 

CLARITY試劑列表

產(chǎn)品編號(hào)	中文名稱(chēng)	規(guī)格	包裝
017-08012	丙烯酰胺	電泳用	25 g
019-08011			100 g
011-08015			500 g
138-06032	N,N'-亞甲基雙(丙烯酰胺)	電泳用	25 g
130-06031			100 g
163-25265	磷酸緩沖液	細(xì)胞培養(yǎng)用	500 mL
160-16061	多聚甲醛	組織固定用	100 g
162-16065			500 g
163-25983	16w/v% 低聚甲醛溶液	電子顯微鏡用	10 mL×10A
198-08853	皂素	和光一級(jí)	1 g
192-08851			5 g
029-02191	硼酸	試劑特級(jí)	100 g
021-02195			500 g
023-02194			4 kg
190-13982	十二烷基硫酸鈉	分子生物學(xué)用	25 g
192-13981			100 g
194-13985			500 g