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雙11?侃侃這11種常用色譜分析方法

閱讀:3960發(fā)布時(shí)間:2021-11-8

 色譜法根據(jù)其分離原理可分為:吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與排阻色譜法等。又可根據(jù)分離方法分為:紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。
 紙色譜法:紙色譜法系以紙為載體,以紙上所含水分或其他物質(zhì)為固定相,用展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)的分配色譜法。供試品經(jīng)展開(kāi)后,可用比移值(Rf)表示其各組成成分的位置(比移值=原點(diǎn)中心至斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)中心至展開(kāi)劑前沿的距離)。用作藥品鑒別時(shí),供試品在色譜圖中所顯主斑點(diǎn)的位置與顏色(或熒光),應(yīng)與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在色譜圖中所顯主斑點(diǎn)相同;用作藥品純度檢查時(shí),取一定量的供試品,經(jīng)展開(kāi)后,按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,檢視其所顯雜質(zhì)斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)和呈色深度(或熒光強(qiáng)度);進(jìn)行藥品含量測(cè)定時(shí),將待測(cè)色譜斑點(diǎn)剪下經(jīng)洗脫后,再用適宜的方法測(cè)定。該方法需要點(diǎn)樣器、展開(kāi)容器、色譜濾紙等。
  薄層色譜法:
  薄層色譜法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上,在展開(kāi)容器內(nèi)用展開(kāi)劑展開(kāi),使供試品所含成分分離,所得色譜圖與適宜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按同法所得的色譜圖對(duì)比,亦可用薄層色譜掃描儀進(jìn)行掃描,用于鑒別、檢査或含量測(cè)定。該方法需要薄層板、點(diǎn)樣器、展開(kāi)容器、顯色裝置、檢視裝置或波層色譜掃描儀。
  柱色譜法:
  色譜柱為內(nèi)徑均勻、下端(帶或不帶活塞)縮口的硬質(zhì)玻璃管,端口或活塞上部鋪墊適量棉花或玻璃纖維,管內(nèi)裝人吸附劑。吸附劑的顆粒應(yīng)盡可能大小均勻,以保證良好的分離效果。除另有規(guī)定外,通常采用直徑為0.07?0.15mm的顆粒。色譜柱的大小,吸附劑的品種和用量,以及洗脫時(shí)的流速,均按各品種項(xiàng)下的規(guī)定。根據(jù)原理可分為吸附柱色譜、分配柱色譜。
  高效液相色譜法:高效液相色譜法系采用髙壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵裝有填充劑的色譜柱,對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品,由流動(dòng)相帶人色譜柱內(nèi),各組分在柱內(nèi)被分離,并進(jìn)人檢測(cè)器檢測(cè),由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。髙效液相色譜儀由髙壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。色譜柱內(nèi)徑一般為3.9?4.6mm,填充劑粒徑為3?l0um。超高效液相色譜儀是適應(yīng)小粒徑(約2um)填充劑的耐超髙壓、小進(jìn)樣量、低死體積、高靈敏度檢測(cè)的高效液相色譜儀。檢測(cè)器常用的有紫外-可見(jiàn)分光檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。
  離子色譜法:離子色譜法系采用高壓輸液泵系統(tǒng)將規(guī)定的洗脫液帶入裝有填充劑的色譜柱對(duì)可解離物質(zhì)進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品,由洗脫液帶入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離后,進(jìn)入檢測(cè)器(必要時(shí)經(jīng)過(guò)抑制器或衍生系統(tǒng)),由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄并處理色譜信號(hào)。離子色譜法常用于無(wú)機(jī)陰離子、無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、有機(jī)酸、糖醇類、氨基糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖蛋白等物質(zhì)的定性和定量分析。它的分離機(jī)理主要為離子交換,即基于離子交換色譜固定相上的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子之間進(jìn)行的可逆交換;離子色譜法的其他分離機(jī)理還有形成離子對(duì)、離子排阻等。離子色譜儀器中所有與洗脫液或供試品接觸的管道、器件均應(yīng)使用惰性材料,如聚醚醚酮(PEEK)等。電導(dǎo)檢測(cè)器是離子色譜常用的檢測(cè)器,其他檢測(cè)器有安培檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等。
  分子排阻色譜法:分子排阻色譜法是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經(jīng)過(guò)修飾的凝膠如葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)等為填充劑,這些填充劑表面分布著不同孔徑尺寸的孔,藥物分子進(jìn)人色譜柱后,它們中的不同組分按其分子大小進(jìn)人相應(yīng)的孔內(nèi),大于所有孔徑的分子不能進(jìn)人填充劑顆粒內(nèi)部,在色譜過(guò)程中不被保留,早被流動(dòng)相洗脫至柱外,表現(xiàn)為保留時(shí)間較短;小于所有孔徑的分子能自由進(jìn)人填充劑表面的所有孔徑,在色譜柱中滯留時(shí)間較長(zhǎng),表現(xiàn)為保留時(shí)間較長(zhǎng);其余分子則按分子大小依次被洗脫。
  圖片
  氣相色譜法:
  氣相色譜法系采用氣體為流動(dòng)相(載氣)流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后,被載氣帶人色譜柱進(jìn)行分離,各組分先后進(jìn)人檢測(cè)器,用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。所用的儀器為氣相色譜儀,由載氣源、進(jìn)樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。適合氣相色譜法的檢測(cè)器有火焰離子化檢測(cè)器(FID)、熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)、氮磷檢測(cè)器(NPD)、火焰光度檢測(cè)器(FPD)、電子捕獲檢測(cè)器(ECD)、質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)等。
  超臨界流體色譜法:超臨界流體色譜法(supercriticalfluidchromatography,SFC)是以超臨界流體作為流動(dòng)相的一種色譜方法。所謂超臨界流體,是指既不是氣體也不是液體的—些物質(zhì),它們的物理性質(zhì)介于氣體和液體之間,臨界溫度通常髙于物質(zhì)的沸點(diǎn)和三相點(diǎn)。超臨界流體具有對(duì)于色譜分離極其有利的物理性質(zhì)。它們的這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間,使超臨界流體色譜兼具氣相色譜和液相色譜的特點(diǎn)。臨界流體色譜中的色譜柱可以是填充柱也可以是毛細(xì)管柱,分別為填充柱超臨界流體色譜法(pSFC)和毛細(xì)管超臨界流體色譜法(cSFC)。
  臨界點(diǎn)色譜法:臨界點(diǎn)色譜法(liquidchromatographyatcriticalcondition,LCCC)是根據(jù)聚合物的功能基、嵌段結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)行聚合物分離的一種色譜技術(shù)。臨界點(diǎn)色譜法的原理是基于臨界點(diǎn)之上、臨界點(diǎn)之下以及臨界點(diǎn)附近的標(biāo)度理論。當(dāng)使用多孔填充材料作為固定相時(shí),分子排阻色譜(sizeexclusionchromatography,SEC)和相互作用色譜(interactionchromatography,IC)的分離機(jī)制在分離聚合物時(shí)同時(shí)發(fā)生作用。在某個(gè)特殊色譜條件(固定相、流動(dòng)相的組成、溫度)下,存在兩種分離機(jī)制的臨界點(diǎn),被稱為焓熵互補(bǔ)點(diǎn)或色譜臨界條件(criticalconditions)或臨界吸附點(diǎn)(criticaladsorptionpoint,CAP)。在這一點(diǎn),聚合物分子按照分子末端功能基團(tuán)的不同或嵌段結(jié)構(gòu)的差異分離,與聚合物的摩爾質(zhì)量(分子量)無(wú)關(guān),聚合物的洗脫體積等于色譜柱的空隙體積。此時(shí)聚合物的長(zhǎng)鏈成為了“色譜不可見(jiàn)”(chromatographicallyinvisible)。
  電泳法:電泳是指溶解或懸浮于電解液中的帶電荷的蛋白質(zhì)、膠體、大分子或其他粒子,在電流作用下向其自身所帶電荷相反的電極方向遷移。電泳法是指利用溶液中帶有不同量電荷的陽(yáng)離子或陰離子,在外加電場(chǎng)中使供試品組分以不同的遷移速度向?qū)?yīng)的電極移動(dòng),實(shí)現(xiàn)分離并通過(guò)適宜的檢測(cè)方法記錄或計(jì)算,達(dá)到測(cè)定目的的分析方法。電泳法一般可分為兩大類:一類為自由溶液電泳或移動(dòng)界面電泳,另一類為區(qū)帶電泳。
  移動(dòng)界面電泳是指不含支持物的電泳,溶質(zhì)在自由溶液中泳動(dòng),故也稱自由溶液電泳。區(qū)帶電泳指含有支持介質(zhì)的電泳,帶電荷的供試品(如蛋白質(zhì)、核苷酸等大分子或其他粒子)在惰性支持介質(zhì)(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中,在電場(chǎng)的作用下,向其極性相反的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng),使組分分離成狹窄的區(qū)帶。
  毛細(xì)管電泳法:毛細(xì)管電泳法是指以彈性石英毛細(xì)管為分離通道,以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,根據(jù)供試品中各組分淌度(單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的遷移速度)和(或)分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種分析方法。其分離模式有:毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管等速電泳(CITP)、毛細(xì)管等速電泳(CITP)、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MEKC)、親和毛細(xì)管電泳(ACE)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、毛細(xì)管電色譜(CEC)、毛細(xì)管陣列電泳(CAE)、芯片式毛細(xì)管電泳(ChipCE)。

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