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Rat eNOS-3ElisaKit

本試劑僅供研究使用  標本：血清或血漿及相關(guān)液體

原理：

采用雙抗體夾心法測定MTHFD2水平。用純化的MTHFD2抗體包被微孔板，制成固相載體，實驗時依次在微孔板中加入樣本及標準品，并加入 HRP 標記的 ABP 抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，反復(fù)洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍色，再用硫酸終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成黃色。顏色的深淺和樣品中的 ABP含量呈正相關(guān)。采用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值），根據(jù)標準曲線，計算測試樣品中 ABP 濃度。

試劑盒組成：

性能:

1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié)果判斷與分析:

1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的待測物質(zhì)標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的待測物質(zhì)含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

操作步驟：

1. 取出試劑盒，室溫（20-25℃）放置 30 分鐘。

2. 分組：取出 96 孔板，根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。分別設(shè)標準

品組（6 個濃度）、空白孔、待測樣品組。

注：為減少實驗誤差，保證準確性，建議設(shè)置復(fù)孔。

3. 加樣：依照標準品的順序分別加入 50ul 的標準品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入 50ul 的蒸餾水；其余微孔中加入 50ul

的待測樣本。

4. 加酶標溶液：標準品組、待測樣本組各孔中加入 100ul 的酶標溶液（空白對照孔除外）。

5. 溫育：酶標板用封板紙密封后，放入濕盒內(nèi)于 37℃恒溫孵育 1 小時。

6. 洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置 15-30s，充分清洗酶標板 5 次，用吸水紙拍干。

7. 顯色：各孔加入顯色劑 A 液 50ul 后，再加入顯色劑 B 液 50ul。

8. 終止：25-37℃下避光反應(yīng) 10-15 分鐘，加入 50ul 終止液。

9. 讀板：在 450nm 波長讀取各孔的 OD 值。
ELISA試劑盒為什么要嚴格按照說明書操作？

一.先說最嚴重的操作錯誤，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當(dāng)作雙抗體夾心法來做，導(dǎo)致的結(jié)果就是整板顯示很強的藍色，無任何梯度。

二.混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導(dǎo)致的結(jié)果是，浪費珍貴的樣本，樣品的回收率達不到預(yù)期值，如果混用不同試劑盒的酶復(fù)合物，會導(dǎo)致顯色過弱或過強，因為每種試劑盒所用酶復(fù)合物效價可能不一樣。

三.不看文獻或者不做預(yù)實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻報道推算樣本應(yīng)該1:10稀釋，結(jié)果稀釋成1:1000，導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過弱，結(jié)果不可用。

車.不校準移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導(dǎo)致工作試劑濃度不準確，孵育溫度不合適，實驗帶來誤差。

五.洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導(dǎo)致的結(jié)果是顯色過快，同時背景較高。

六.手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液，導(dǎo)致洗液污染，整個實驗失敗。

七.剩余酶標板條未及時放入干燥袋，導(dǎo)致酶標板受潮，下一次再做時，顯色過弱或污染，CV值過高。

八.試劑盒保存條件不當(dāng)。試劑盒要求放4℃的，放在了-20℃?；蛘咭蠓?20℃的，放在了4℃。均會導(dǎo)致試劑盒敏感性下降。

以上只是最常見的操作錯誤。順利完成一次ELISA實驗需要注意的細節(jié)很多，許多操作環(huán)節(jié)都影響到檢測的質(zhì)量。

公司正在出售的產(chǎn)品：