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上海申知心生物科技有限公司

主營(yíng)產(chǎn)品: 高血脂癥動(dòng)物模型,心血管疾病動(dòng)物模型,缺血性心臟病動(dòng)物模型

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transwell實(shí)驗(yàn)服務(wù)
transwell實(shí)驗(yàn)服務(wù)
參考價(jià) 99
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具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)
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更新時(shí)間:2023-08-28 07:46:27瀏覽次數(shù):1962

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【簡(jiǎn)單介紹】
transwell實(shí)驗(yàn):Transwell放入培養(yǎng)板后,分為兩室:Transwell小室內(nèi)稱上室,盛裝上層培養(yǎng)液;培養(yǎng)板內(nèi)稱下室,盛裝下層培養(yǎng)液。上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。
【詳細(xì)說(shuō)明】

transwell實(shí)驗(yàn)

transwell實(shí)驗(yàn)
一類有通透性的杯狀的裝置;其外形為一個(gè)可放置在孔板里的小杯子,杯子底層的一張有通透性的膜(一般為聚碳酸酯膜)。該膜微孔的大小在0.1-12.0µm之間。
Transwell放入培養(yǎng)板后,分為兩室:Transwell小室內(nèi)稱上室,盛裝上層培養(yǎng)液;培養(yǎng)板內(nèi)稱下室,盛裝下層培養(yǎng)液。上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。

應(yīng)用
細(xì)胞種在上室內(nèi),因聚碳酸酯膜有通透性,故可研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。
根據(jù)transwell的特點(diǎn)(孔徑,膜),可進(jìn)行如下方面研究:
1.共培養(yǎng)                   孔徑<3.0um
研究下室細(xì)胞B代謝物(分泌物)對(duì)上室細(xì)胞A的影響。
2.細(xì)胞趨化               孔徑可選擇5.0、8.0、12.0µm
研究進(jìn)入下室的細(xì)胞量,反映下室成分對(duì)上室細(xì)胞的趨化能力
3.細(xì)胞遷移               孔徑常選擇8.0、12.0µm
研究進(jìn)入下室的細(xì)胞量,反應(yīng)上室細(xì)胞的遷移能力
4.細(xì)胞侵襲               孔徑常選擇8.0、12.0µm,膜上室側(cè)鋪有基質(zhì)膠,
研究進(jìn)入下室的細(xì)胞量,反映上室細(xì)胞的侵襲能力

具體應(yīng)用例子
一、腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(transwell)
原理:
模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì),細(xì)胞只有分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),降解基質(zhì)膠才可進(jìn)入下室。

步驟
1.  Transwell小室準(zhǔn)備
1)無(wú)基質(zhì)膠Transwell小室制備
A. 包被基底膜:
A. Matrigel (50mg/L)按1:8稀釋,無(wú)血清培養(yǎng)基作為稀釋液
B. 取適量加入Transwell小室中(24孔板transwell小室加100 ul),4℃操作。
C. 37℃培養(yǎng)箱中,孵育4-5h(>5h);出現(xiàn)“白色層"時(shí),說(shuō)明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。

2)有基質(zhì)膠Transwell小室制備
A. 小室放入培養(yǎng)板中,上室加入300µl預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基
B. 室溫下靜置15-30min,使基質(zhì)膠再水化
C. 再吸去剩余培養(yǎng)液。

2.細(xì)胞懸液準(zhǔn)備
1)消化、收集細(xì)胞;
2)PBS洗1-2次
3)用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸(細(xì)胞密度約在1-10×105/ml)。

3. 細(xì)胞接種
1)取適量細(xì)胞懸液加入Transwell小室(按transwell說(shuō)明)。24孔板小室一般200µl。
2)24孔板下室一般加入500µl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。注意避免氣泡產(chǎn)生(下層培養(yǎng)液和小室間)
3) 培養(yǎng)細(xì)胞:常規(guī)培養(yǎng)12-48h(主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定)。

4. 結(jié)果統(tǒng)計(jì)
檢測(cè)穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)有兩種方法:
1 ) 直接計(jì)數(shù)法
“貼壁"細(xì)胞計(jì)數(shù):
“貼壁"是指細(xì)胞穿過(guò)膜后,可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去。 通過(guò)給細(xì)胞染色,可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞
A. 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞
B. 染色:常用的0.1%結(jié)晶紫染色。
優(yōu)點(diǎn):(1) 不需固定細(xì)胞,直接染色即可。
(2) 配制簡(jiǎn)單方便。
(3) 可以用33%醋酸脫色,測(cè)量洗脫液OD570值,間接反映細(xì)胞數(shù)
注意,染色前要將膜風(fēng)干,否則可能會(huì)染不上。
C. 細(xì)胞計(jì)數(shù):
(1) 顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照
(2) 取3-5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)

2) 間接計(jì)數(shù)法
用于穿過(guò)細(xì)胞過(guò)多,而無(wú)法通過(guò)計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)。
MTT法
A. 棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞
B. 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的培養(yǎng)基,將小室浸沒(méi)于其中,置于37℃2-4h后取出。
C. 24孔板中加入500µl DMSO,將小室浸沒(méi)于其中,振蕩結(jié)晶充分溶解。
D. 取出小室,測(cè)所得DMSO的OD值。
結(jié)晶紫檢測(cè)
A. 棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞
B. (可選)甲醛固定30分鐘,室溫
B. 24孔板中加入500µl  0.1%結(jié)晶紫溶液,將小室浸沒(méi)于其中,室溫放置20分鐘
C. 24孔板中加入500µl 33%醋酸,將小室浸沒(méi)于其中,脫色。
D. 取出小室,測(cè)量洗脫液OD570值。
優(yōu)點(diǎn):染色和脫色的過(guò)程并不影響膜上細(xì)胞,在脫色后還可重新染色。

5. 注意點(diǎn)
①Transwell小室:
注意是否是預(yù)先鋪好膠
② 上層培養(yǎng)液:
上層培養(yǎng)液采用無(wú)血清培養(yǎng)基,為維持滲透壓,一般加入0.05%-0.2% BSA。
③ 細(xì)胞:
有侵襲能力的細(xì)胞才可用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。
④ 基質(zhì)膠:
常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel
⑤ 下層培養(yǎng)液:
下層常用含5%-10% FBS的培養(yǎng)基,具體濃度根據(jù)細(xì)胞侵襲力而定,侵襲力弱的細(xì)胞可適當(dāng)提高FBS濃度。
⑥ 細(xì)胞培養(yǎng)板:
細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購(gòu)買(mǎi)的Transwell小室相配套。

二、腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell)
過(guò)程與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)基本*,不同的只是不需要鋪Matrigel。
步驟
1.Transwell放入預(yù)先每孔加有600ul的培養(yǎng)基(含10%血清)的24孔板內(nèi),
2.在Transwell的內(nèi)室加入細(xì)胞(100ul,用含0.1%血清的培養(yǎng)基稀釋到所需密度),
3.放入細(xì)胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng)時(shí)間后取出。
4.取出Transwell,用棉簽擦去膜(內(nèi)室一側(cè))的細(xì)胞
5.另一面的細(xì)胞用甲醛室溫固定30分鐘
6. 結(jié)晶紫染色20分鐘,
7. PBS或清水洗3次,
8.顯微鏡下觀察細(xì)胞,記數(shù)。




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