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上海申知心生物科技有限公司

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transwell實驗服務
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更新時間:2023-08-28 07:46:27瀏覽次數:1959

聯(lián)系我們時請說明是化工儀器網上看到的信息,謝謝!

【簡單介紹】
transwell實驗:Transwell放入培養(yǎng)板后,分為兩室:Transwell小室內稱上室,盛裝上層培養(yǎng)液;培養(yǎng)板內稱下室,盛裝下層培養(yǎng)液。上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。
【詳細說明】

transwell實驗

transwell實驗
一類有通透性的杯狀的裝置;其外形為一個可放置在孔板里的小杯子,杯子底層的一張有通透性的膜(一般為聚碳酸酯膜)。該膜微孔的大小在0.1-12.0µm之間。
Transwell放入培養(yǎng)板后,分為兩室:Transwell小室內稱上室,盛裝上層培養(yǎng)液;培養(yǎng)板內稱下室,盛裝下層培養(yǎng)液。上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。

應用
細胞種在上室內,因聚碳酸酯膜有通透性,故可研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。
根據transwell的特點(孔徑,膜),可進行如下方面研究:
1.共培養(yǎng)                   孔徑<3.0um
研究下室細胞B代謝物(分泌物)對上室細胞A的影響。
2.細胞趨化               孔徑可選擇5.0、8.0、12.0µm
研究進入下室的細胞量,反映下室成分對上室細胞的趨化能力
3.細胞遷移               孔徑常選擇8.0、12.0µm
研究進入下室的細胞量,反應上室細胞的遷移能力
4.細胞侵襲               孔徑常選擇8.0、12.0µm,膜上室側鋪有基質膠,
研究進入下室的細胞量,反映上室細胞的侵襲能力

具體應用例子
一、腫瘤細胞侵襲實驗(transwell)
原理:
模仿體內細胞外基質,細胞只有分泌基質金屬蛋白酶(MMPs),降解基質膠才可進入下室。

步驟
1.  Transwell小室準備
1)無基質膠Transwell小室制備
A. 包被基底膜:
A. Matrigel (50mg/L)按1:8稀釋,無血清培養(yǎng)基作為稀釋液
B. 取適量加入Transwell小室中(24孔板transwell小室加100 ul),4℃操作。
C. 37℃培養(yǎng)箱中,孵育4-5h(>5h);出現(xiàn)“白色層"時,說明已經變?yōu)楣虘B(tài)。

2)有基質膠Transwell小室制備
A. 小室放入培養(yǎng)板中,上室加入300µl預溫的無血清培養(yǎng)基
B. 室溫下靜置15-30min,使基質膠再水化
C. 再吸去剩余培養(yǎng)液。

2.細胞懸液準備
1)消化、收集細胞;
2)PBS洗1-2次
3)用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸(細胞密度約在1-10×105/ml)。

3. 細胞接種
1)取適量細胞懸液加入Transwell小室(按transwell說明)。24孔板小室一般200µl。
2)24孔板下室一般加入500µl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。注意避免氣泡產生(下層培養(yǎng)液和小室間)
3) 培養(yǎng)細胞:常規(guī)培養(yǎng)12-48h(主要依癌細胞侵襲能力而定)。

4. 結果統(tǒng)計
檢測穿過的細胞數有兩種方法:
1 ) 直接計數法
“貼壁"細胞計數:
“貼壁"是指細胞穿過膜后,可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去。 通過給細胞染色,可在鏡下計數細胞
A. 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞
B. 染色:常用的0.1%結晶紫染色。
優(yōu)點:(1) 不需固定細胞,直接染色即可。
(2) 配制簡單方便。
(3) 可以用33%醋酸脫色,測量洗脫液OD570值,間接反映細胞數
注意,染色前要將膜風干,否則可能會染不上。
C. 細胞計數:
(1) 顯微鏡進行觀察和拍照
(2) 取3-5個視野計數細胞個數

2) 間接計數法
用于穿過細胞過多,而無法通過計數獲得準確的細胞數。
MTT法
A. 棉簽擦去基質膠和上室內的細胞
B. 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的培養(yǎng)基,將小室浸沒于其中,置于37℃2-4h后取出。
C. 24孔板中加入500µl DMSO,將小室浸沒于其中,振蕩結晶充分溶解。
D. 取出小室,測所得DMSO的OD值。
結晶紫檢測
A. 棉簽擦去基質膠和上室內的細胞
B. (可選)甲醛固定30分鐘,室溫
B. 24孔板中加入500µl  0.1%結晶紫溶液,將小室浸沒于其中,室溫放置20分鐘
C. 24孔板中加入500µl 33%醋酸,將小室浸沒于其中,脫色。
D. 取出小室,測量洗脫液OD570值。
優(yōu)點:染色和脫色的過程并不影響膜上細胞,在脫色后還可重新染色。

5. 注意點
①Transwell小室:
注意是否是預先鋪好膠
② 上層培養(yǎng)液:
上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基,為維持滲透壓,一般加入0.05%-0.2% BSA。
③ 細胞:
有侵襲能力的細胞才可用于Transwell侵襲實驗。
④ 基質膠:
常用的是人工重構基底膜材料Matrigel
⑤ 下層培養(yǎng)液:
下層常用含5%-10% FBS的培養(yǎng)基,具體濃度根據細胞侵襲力而定,侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。
⑥ 細胞培養(yǎng)板:
細胞培養(yǎng)板應當與購買的Transwell小室相配套。

二、腫瘤細胞遷移實驗(Transwell)
過程與Transwell侵襲實驗基本*,不同的只是不需要鋪Matrigel。
步驟
1.Transwell放入預先每孔加有600ul的培養(yǎng)基(含10%血清)的24孔板內,
2.在Transwell的內室加入細胞(100ul,用含0.1%血清的培養(yǎng)基稀釋到所需密度),
3.放入細胞培養(yǎng)箱,培養(yǎng)時間后取出。
4.取出Transwell,用棉簽擦去膜(內室一側)的細胞
5.另一面的細胞用甲醛室溫固定30分鐘
6. 結晶紫染色20分鐘,
7. PBS或清水洗3次,
8.顯微鏡下觀察細胞,記數。




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