HILIC方法學是一個強大的工具，特別適用于分析極性化合物，但實施起來可能很具挑戰(zhàn)性，并且有幾個重要的因素需要注意，以避免常見的缺陷。 本文將介紹HILIC技術，討論常見的問題領域，并幫助您成功地將HILIC方法整合到您的實驗室中。

“HILIC”代表親水相互作用液相色譜。 它是一種使用極性固定相的分離模式，可以是裸硅膠，如Raptor HILIC-Si色譜柱，也可以是極性鍵合相，如Raptor FluoroPhenyl色譜柱。HILIC方法中使用的溶劑類似于反相LC中使用的溶劑（例如水，甲醇和乙腈），也可以使用揮發(fā)性緩沖劑和改性劑。 因為HILIC固定相是極性的，所以該技術非常適合分析在C8和C18等典型反轉相上保留有限或無保留的極性分子。

 HILIC有時也被稱為“反向反相”，因為在此水是“強”洗脫溶劑或溶劑，與反相LC中水是“弱”溶劑相反（圖1）。在HILIC分離中，初始條件是高有機相（通常為60％或更多），并且水層被吸附在二氧化硅表面上。這種會在流動相中形成的水層的存在有時被描述為梯度，因為當它接近二氧化硅表面時，它會逐漸富含水分。由于它們可溶于水層，因此極性分析物可與極性顆粒表面相互作用，并以多種方式保留，包括氫鍵合，取向力和離子交換。 例如，Raptor HILIC-Si色譜柱可提供離子交換和分配的良好組合，與其他HILIC型相比，可實現更多的選擇性和保留。

色譜柱活化和再平衡對于保留時間重現性至關重要

確保HILIC方法成功的步是了解分析柱必須在使用前進行適當活化，并且在進樣之間充分平衡。 如果不能在兩次運行之間活化并平衡色譜柱，則可能導致水層無法在顆粒表面*重新建立，從而導致保留時間不可重復。為了在使用前活化色譜柱，必須使用分析過程中將使用的流動相進行沖洗。對于等度HILIC方法，應使用至少50個色譜柱體積，對于梯度HILIC方法，應至少*運行10次空白樣。 當您改變流動相組成或任何添加劑的濃度時，也需要活化。與次活化色譜柱時一樣，使用相同數量的色譜柱體積或空白進樣。除了使用流動相對色譜柱進行初始活化外，重要的是色譜柱在進樣之間重新平衡。 由于HILIC方法中的分離機理涉及在顆粒表面上吸附水層，因此在注入之間*重新建立或“重置”該水層以確保保留時間重現性是非常重要的。 我們建議在梯度程序返回初始條件或等度分離時開始至少10個柱體積的平衡，從后一個峰的保留時間開始至少10個柱體積。 *重新平衡所需的色譜柱體積數量可能非常依賴于分析物，尤其是等度分離時，所以請確保您研究HILIC方法開發(fā)過程中的保留時間重現性。表I列出了Raptor HILIC-Si色譜柱各個尺寸的色譜柱體積?；罨瘯r，乘以推薦的50等度方法以確定所需活化溶劑的總體積，然后除以流量計算總活化時間。 為了平衡，對于所需的平衡體積，將表中對應于色譜柱尺寸的值乘以10; 然后除以流量計算方法程序中的平衡時間間隔。

例如，使用100 mm x 2.1 mm內徑色譜柱時，一個色譜柱體積為0.2 mL。 如果我們運行流速為0.30 mL/min的等度方法， 那么色譜柱應至少用10 mL（50×0.2 mL）活化，總活化時間為33分鐘（10mL÷0.30 mL/min）。同樣，每次進樣之間重新平衡的體積為2mL（10×0.2mL），再平衡時間為7分鐘（2 mL÷0.30 mL/min）。這些計算可用于確定一個良好的起點，但重新平衡時間與分析物有關，因此需要開發(fā)方法以確保重新平衡充分，并導致可重現的保留時間。

樣品溶劑匹配對于良好的峰形是至關重要的

如果您有使用反相分離的經驗，您會知道，如果樣品溶劑與色譜流動相有很大差異，則峰形會有很大差異。在HILIC方法中也是如此，因此樣品溶劑盡可能匹配有機物含量高的初始流動相是非常重要的。好消息是，如果您正在使用SPE進行樣品制備，您將在高度有機溶劑中進行洗脫，因此樣品提取物可能已經準備好進行HILIC分析。圖2顯示了溶劑匹配對峰形的影響。如果樣品是100％水溶液，敵草快的峰形差，兩種化合物洗脫快，信號相對較低，而樣品溶于流動相B（75％乙腈）。通過將注射溶劑與初始流動相條件相匹配，您可以獲得更好的峰形，更高的保留率和更高的靈敏度。

流動相pH值影響依賴于分析物

流動相除了需要與樣品溶劑匹配外，流動相的pH值也會影響色譜性能。事實上，方法開發(fā)和評估在這方面為重要， 因為pH對分析物電荷狀態(tài)的影響因各化合物的pKa而異。使用HILIC方法時，流動相中高濃度的有機溶劑會提高pH值， 實際的洗脫液pH值可能比單獨使用含水部分高1-1.5個單位。色譜柱本身的電荷狀態(tài)也會受到影響。例如，在Raptor HILIC-Si色譜柱中，裸二氧化硅的pKa介于3.8和4.5之間，因此流動相pH會改變二氧化硅表面的電荷，使其在pH值接近3.8及以上，非常酸性及離子化（帶負電）的條件下呈中性。因此，如果您的分析物含有一個或多個質子化的胺或季胺基團，則它是使用Raptor HILIC-Si色譜柱分析的理想選擇。

緩沖液選擇影響色譜和儀器性能

緩沖液用于保持洗脫液的pH恒定，并且還可以幫助將目標分析物與干擾物分離。許多HILIC分離使用質譜檢測器，因此揮發(fā)性緩沖液如甲酸銨和乙酸銨應用非常普遍。由于兩個主要原因，HILIC分離中的緩沖液濃度很重要。首先，流動相的高有機物含量會導致緩沖鹽沉淀在自動進樣器和色譜柱之間，色譜柱熔塊過濾上或色譜柱中。所有這些情況都可能導致您的儀器進行停機維護。第二個考慮因素特別涉及發(fā)生在Raptor HILIC-Si色譜柱中的保留機制。回想一下，在典型的HILIC流動相條件下，二氧化硅表面具有負電荷，因此帶正電荷的緩沖離子與目標分析物競爭保留。如果緩沖液濃度較高，則可以降低分析物的保留時間。與pH一樣，需要優(yōu)化方法，但10 mM是緩沖液濃度的良好起點。 A和B兩種流動相均應進行均勻緩沖，以保持梯度中的離子強度恒定，以獲得一致的質譜檢測器響應。請向您的MS供應商咨詢他們推薦用于ESI源的大緩沖液濃度。

結論

與任何新技術一樣，能否成功的應用在很大程度上取決于是否理解新方法和更熟悉的程序之間的差異。 HILIC方法為分析極性化合物提供了一種強大的新方法，但如果分析人員認為其與反相LC相似，則實施可能具有挑戰(zhàn)性。 使用HILIC方法，確保色譜柱的正確活化（無論是使用新柱，還是溶劑或添加劑改變時），再就是在進樣之間重新平衡; 將樣品溶劑與初始流動相匹配; 并了解流動相pH和緩沖液的選擇對分析的影響是取得良好結果的重要步驟。 這些指南為建立HILIC方法提供了一個很好的起點，但方法開發(fā)對于確保您的特定目標分析物具有優(yōu)異性能至關重要。