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構(gòu)建一個高度可重復(fù)的單細胞文庫WGA單細胞全基因組擴增試劑盒
閱讀：3766發(fā)布時間：2017-5-3
構(gòu)建一個高度可重復(fù)的單細胞文庫
Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX® WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒
The ability to amplify DNA to yield a highly reproducible library from a single cell is now possible! The PicoPLEX WGA kit with patented technology* is designed and optimized for amplification of single copy genomic DNA starting with a single cell. The easy-to-use single tube protocol reduces handling errors, dramatically improves time to results and reduces background. PicoPLEX WGA Kit can be also be used with isolated gDNA amounts ranging from less than 6 pg to 50 pg. Accepted for use in array CGH analysis as well as PCR.
PicoPLEX WGA Kits are used and trusted by leading providers in the IVF community such as BlueGnome for pre-implantation genetic screening and diagnostics (PGS/PGD).
單細胞全基因組PGS/PGD診斷的金標準
This assay involves removing a polar body from a fertilized egg or single cells from five to ten embryos on day 3 post fertilization. After the cells are lysed, the released DNA is then amplified and the amplification product labeled and hybridized to a microarray containing genomic targets.Software analysis identifies copy number variations. PicoPLEX WGA technology has become the standard DNA amplification technique for PGS due to extreme robustness and reproducibility *的穩(wěn)健性和重復(fù)性. The same PicoPLEX WGA technology can also be applied to genetic characterization of any single cell sample or picogram quantities of isolated DNA.
Overview
Pre-implantation genetic screening and diagnosis (PGS, PGD) refers to testing done to an embryo or oocyte as a part of an in vitro fertilization (IVF) procedure to select embryos that do not have chromosomal disorders or carry familial disease alleles, increasing the chance of successful pregnancy and decreasing the risk of passing on certain genetic disorders. Microarray analysis is the most common PGS technique performed in IVF clinics, and several kits that contain PicoPLEX technology are widely available. These include Illumina’s 24Sure Arrays, Perkin Elmer’s KaryoLite BoBs developed for PSG and Oxford Gene Technology’s CytoSure™ Arrays. Labs are increasingly turning to low pass NGS for these assays and PicoPLEX DNA-seq was developed to fill this need.
Workflow
PicoPLEX Technology*
PicoPLEX uses random primer extension with non-complementary primers to yield a library with a high systematic bias and very low stochastic bias.
微量DNA的金鑰匙：單細胞全基因組擴增試劑盒 三步法可靠 Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX® WGA Kit Whole Genome Amplification from Single Cells
Rubicon Genomics成立于2000年，總部位于美國密歇根州。該公司的核心競爭力產(chǎn)品包括酶學(xué)、核酸化學(xué)、樣品的加工生產(chǎn)，該公司致力于創(chuàng)新、知識產(chǎn)權(quán)的發(fā)展和持續(xù)的產(chǎn)品開發(fā)。
Rubicon Genomics開發(fā)創(chuàng)新、高品質(zhì)的、核酸文庫的制備及配套產(chǎn)品，能夠?qū)εR床樣本進行簡單、快速可靠和高靈敏度的分析。
美國Rubicon Genomics---單細胞測序文庫構(gòu)建的
1. 二代測序建庫試劑（微量起始樣品 50pg - 50ng）
2. 單細胞擴增和單細胞測序建庫試劑（廣泛應(yīng)用于生殖領(lǐng)域，是該領(lǐng)域的金標準。）
3. 全RNA擴增試劑（微量起始樣品，可以低至10個細胞的總RNA）
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【產(chǎn)品介紹】
Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX® WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒
是應(yīng)用于一般用途的Illumina下一代測序（NGS）的高性能文庫，ThruPLEX的DNA測序試劑盒具有較低的和更廣泛的輸入范圍。PicoPLEX® WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒具有較低的和更廣泛推薦的輸入范圍比其他工具包。對于Rubicon Genomics 的PicoPLEX® WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒樣品輸入量為20倍，比其他套件更為敏感，從第50和50納克，不需要協(xié)議或適配器濃度的優(yōu)化。索引和適配器附帶套件。
PicoPLEX® WGA Kit高性能的zui低輸入：50 PG 50納克
PicoPLEX® WGA Kit完整的包，用于創(chuàng)建庫：優(yōu)化索引和適配器試劑，酶，緩沖劑，和無核酸酶水
PicoPLEX® WGA Kit 其操作僅在一個管3步驟和僅約2小時，沒有必要調(diào)劑
【產(chǎn)品性能】
Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX® WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒
Amplification of Single Cells is Reproducible
Flow-sorted cancer cells were amplified with the PicoPLEX WGA Kit. Each of the cells (blue lines) amplified at the same rate, and resulted in a similar, predictable yield. The sample containing 0 cells (green lines; no template control) shows very low background.
擴增單個細胞是可重復(fù)的
流分類的癌細胞用PicoPLEX® WGA Kit 單細胞全基因組擴增試劑盒擴增。每個細胞（藍線）以相同的速率擴增，并導(dǎo)致類似的，可預(yù)測的產(chǎn)率。包含0個單元格（綠線，沒有模板控制）的樣本顯示非常低的背景。
單細胞全基因組測序技術(shù)是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項技術(shù)，其原理是對分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進行高通量測序，廣泛應(yīng)用于癌癥研究、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細胞分化、免疫機制、微生物等方向的研究。
獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴增產(chǎn)物是準確全面的測序結(jié)果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無偏好性的擴增，在單細胞測序技術(shù)誕生的近二十年時間里，全基因組擴增技術(shù)經(jīng)歷了幾次重大的變革，WGA主要有三種方式：DOP-PCR，MDA，MALBAC。下面小編就來為大家介紹一下WGA技術(shù)的演變歷程，以及怎樣根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)的擴增方式。
DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction)
技術(shù)原理：簡并寡核苷酸引物PCR，引物的3' 含6bp的隨機序列，可以隨機的和基因組DNA結(jié)合，從而實現(xiàn)對全基因組的擴增[1]。
應(yīng)用范圍：因為PCR的指數(shù)擴增特性，放大了基因組上不同序列之間的差異，因而導(dǎo)致擴增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR適合對染色體的CNV進行定量。
MDA技術(shù)原理：2001年由Laskin團隊發(fā)明，使用隨機的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進行反應(yīng)，該聚合酶具有很強的鏈置換特性，能夠在等溫的條件下，擴增產(chǎn)生50~100kb的DNA片段。同時由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的復(fù)制保真性[2]。
應(yīng)用范圍：MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度，φ29 DNA聚合酶的率及高保真性，使得MDA法在對SNV的分析，以及構(gòu)建大片段文庫上有著顯著優(yōu)勢。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指數(shù)擴增，因此依然存在PCR反應(yīng)的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，這種偏好性并不能重復(fù)，因此MDA法不適合進行CNV的分析。商品化試劑盒代表：Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。
MALBAC技術(shù)原理：2012年由謝曉亮團隊發(fā)明，擬線性的擴增過程降低了指數(shù)擴增的序列偏好性。擴增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的隨機序列，可以和模板在15~20℃的低溫下結(jié)合，經(jīng)過8~12個循環(huán)的擬線性擴增后，再對這些環(huán)狀的擴增子進行指數(shù)擴增[3]。
應(yīng)用范圍：MALBAC法的優(yōu)勢在于，雖然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的這種偏好性在不同的細胞之間是可重復(fù)的，因此可以通過對參考細胞標準化后，進行CNV的分析；另外，由于其擴增的均一性，MALBAC法擴增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在檢測SNV時將會出現(xiàn)更多的假陽性；另外，由于它可重復(fù)性的序列偏好性，基因組上低擴增的區(qū)域有時會在擴增過程中丟失。商品化試劑盒代表：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit; Rubicon, PicoPLEX WGA Kit。
由上述的分析可見，MDA和MALBAC各有優(yōu)劣，實際上在不同的文獻中，研究者也會根據(jù)研究目的的不同，采取不同的方式對基因組進行擴增，以滿足研究的需要[5-7]。
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