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REPLI-g Single Cell Kit單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒操作指南
閱讀：4953發(fā)布時(shí)間：2017-11-3
試劑盒組份
組份 | 規(guī)格 |
REPLI-g sc DNA Polymerase (blue lid) DNA聚合酶（藍(lán)蓋） | 48 µl |
REPLI-g sc Reaction Buffer (yellow lid) 反應(yīng)緩沖液（黃蓋） | 700 µl |
Buffer DLB (clear lid) DLB緩沖液（透明蓋） | 1 tube |
Stop Solution (red lid) 終止液（紅蓋） | 1.8 ml |
PBS sc 1x (clear lid) PBS 1x（透明蓋） | 1.5 ml |
DTT, 1 M (lilac lid) DTT，1M（紫蓋） | 1 ml |
H2O sc 水 | 1.5 ml |
Quick Start Protocol | 1 |
操作方法選擇
根據(jù)起始樣本選擇操作方法
起始樣本 | 方法 |
單細(xì)胞，2-1000個(gè)細(xì)胞 | 方法一：從單細(xì)胞擴(kuò)增基因組DNA |
純化基因組DNA（1-10ng） | 方法二：純化基因組DNA擴(kuò)增 |
其他起始樣本：血漿血清、活檢、需要高通量擴(kuò)增的樣本等參見其他對應(yīng)說明書。
操作流程
方法*程
細(xì)胞樣本——加入變性混合液——65°C孵育10min——加入終止液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴(kuò)增DNA
方法二流程
純化基因組DNA——加入變性混合液——15-25°C孵育3min——加入neutralization混合液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴(kuò)增DNA
需要自備的儀器和試劑
微離心管
水浴或其他加熱儀器
微型離心機(jī)
漩渦混合儀（Vortexer）
吸管和吸頭
冰
方法一：從單細(xì)胞擴(kuò)增基因組DNA
實(shí)驗(yàn)開始前注意事項(xiàng)
1.適用樣本：1-1000個(gè)完整細(xì)胞
這個(gè)方法適用于所有物種的單細(xì)胞樣本，如：脊椎動物，細(xì)菌（革蘭氏陽性菌和陰性菌），植物（細(xì)胞壁已脫），分選細(xì)胞，組織培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞。
不適用樣本：福爾馬林固定樣本或其他使用交聯(lián)劑固定的樣本，如：從福爾馬林固定石蠟包埋組織中激光顯微切割得到的單細(xì)胞樣本。
2.小心試劑不要被外源DNA污染。如：使用干凈獨(dú)立吸頭吸管，在無DNA地方進(jìn)行反應(yīng)操作。
3.純化基因組DNA擴(kuò)增參見方法二。
4.聚合酶要在冰上解凍（見步驟6）。其他成分可以室溫解凍（15–25°C）。
5.配制的D2緩沖液（變性緩沖液）存放不要超過3個(gè)月。
6.陰性對照（無模板）的DNA產(chǎn)量約 40 µg。因?yàn)?/span>REPLI-g 的單細(xì)胞擴(kuò)增反應(yīng)中，引物二聚體的隨機(jī)擴(kuò)增得到高分子量的DNA產(chǎn)物。這一DNA不會影響實(shí)際樣本質(zhì)量，也不會影響下游分析造成陽性結(jié)果。
開始前準(zhǔn)備
1.DLB緩沖液加500µl試劑盒的水混勻，稍微離心溶解。
注意：重組的DLB緩沖液–20°C能放6個(gè)月。
Buffer DLB is pH-labile.
2.所有緩沖液和試劑使用前都要用漩渦混合器充分混勻。
3.水浴，heating block或熱循環(huán)儀溫度設(shè)為30°C。
如果熱循環(huán)儀帶加熱蓋，蓋子溫度設(shè)為70°C。
步驟¢
1.按表1配制足量（整個(gè)擴(kuò)增流程所需）D2緩沖液（變性緩沖液）。
注意：表中提供的D2緩沖液用量足夠進(jìn)行12次反應(yīng)。沒用完的D2緩沖液–20°C 存放，但不要存放超過3個(gè)月。
表1.D2緩沖液配制
成分 | 體積 |
DTT, 1 M | 3 µl |
Buffer DLB (reconstituted) DLB緩沖液（重組，見“開始前準(zhǔn)備”） | 33 µl |
總體積 | 36 µl |
2. 4 µl樣本細(xì)胞（含PBS）加入微離心管。如果細(xì)胞不夠4 µl，加PBS sc補(bǔ)齊。
注意：REPLI-g單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒提供的PBS sc量不夠用于樣本細(xì)胞的連續(xù)稀釋。
可以使用0.5 µl 全血。（Alternatively, 0.5 µl whole blood can be used.）
3.加入3 µl 配制的D2緩沖液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。
注意：確保樣本細(xì)胞沒有貼在緩沖液線上的管壁。
4.65°C孵育10min。
- 加入3 µl 終止液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。冰上保存。
6.冰上解凍REPLI-g sc DNA聚合酶。其他成分室溫解凍，漩渦振蕩后稍微離心。
解凍后REPLI-g sc反應(yīng)緩沖液可能會形成沉淀，漩渦振蕩10s可以溶解沉淀。
7.按表2配制master混合液。混勻，稍微離心。
要點(diǎn)：嚴(yán)格按照表2所列順序配制。加入水和反應(yīng)緩沖液后，稍微漩渦振蕩和離心后再加入DNA聚合酶。
注意：一次性進(jìn)行多次反應(yīng)時(shí)，根據(jù)反應(yīng)數(shù)量等比例增加用量。DNA聚合酶加好后maste混合液要立即投入使用。
表2：master混合液配制
成分 | 體積/反應(yīng) |
H2O sc | 9 µl |
REPLI-g sc Reaction Buffer 反應(yīng)緩沖液 | 29 µl |
REPLI-g sc DNA Polymerase DNA聚合酶 | 2 µl |
總體積 | 40 µl |
多次反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)數(shù)量等比例增加劑量并增加10%。
8.每次反應(yīng)，10 µl 變性DNA（步驟5）加入40 µl master 混合液。
9.30°C孵育8h。
30°C孵育后，水浴或其他加熱儀可以改設(shè)為65°C方便步驟10使用。
注意：如果使用帶加熱蓋的熱循環(huán)儀，蓋子溫度設(shè)為70°C。
10.DNA聚合酶65°C滅活3min。
11.如果不直接使用，擴(kuò)增DNA 短期儲存在4°C，長期儲存在–20°C。
使用REPLI-g 單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增的DNA可以當(dāng)作基因組DNA（zui低凍融循環(huán)），因此推薦zui低核酸儲存密度為100 ng/µl。
12.依照說明書用水或TE適量稀釋擴(kuò)增DNA。用于PCR分析的擴(kuò)增DNA按1:100稀釋，每次PCR反應(yīng)使用2 µl 稀釋后DNA。
13.擴(kuò)增DNA可用于一系列下游應(yīng)用，包括：第二代測序，array CGH和定量PCR。
注意：每50 µl典型反應(yīng)的DNA產(chǎn)量約40 µg，需要正確稀釋。擴(kuò)增DNA定量見附件A。
方法二：純化基因組DNA擴(kuò)增
略。詳情參見原版說明書。中文版翻譯可咨詢紅榮微再。
150343 REPLI-g Single Cell Kit單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒說明書節(jié)選由紅榮微再翻譯整理。
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很多研究人員使用二代測序儀器對生物樣本的DNA序列進(jìn)行分析和基因分型，但經(jīng)常受限于有限的樣本量。150343 REPLI-g Single Cell Kit單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒可均一的擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞（1至1000個(gè)細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞）或純化的基因組DNA，能夠覆蓋基因組所有位點(diǎn)。另有于干血或新鮮或冷凍的組織樣本的實(shí)驗(yàn)方案。所有緩沖液和試劑生產(chǎn)都經(jīng)過嚴(yán)格控制的流程，避免污染DNA，確保每次實(shí)驗(yàn)獲得可靠的結(jié)果。該產(chǎn)品采用多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)，對所有基因組位點(diǎn)進(jìn)行無偏差的擴(kuò)增。與基于PCR的全基因組擴(kuò)增技術(shù)相比，該技術(shù)具有更好的擴(kuò)增高保真度，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性信號。
產(chǎn)品訂購信息
品牌 | 貨號 | 產(chǎn)品描述 |
QiaGen | 150343 | REPLI-g Single Cell Kit單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒 |
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