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看完這些你就知道選擇流式抗體的注意事項是什么了
閱讀：5909發(fā)布時間：2020-5-27
流式細(xì)胞術(shù)是一項非常實用的技術(shù)，其特點(diǎn)是方便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，且能成功的對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選，但是提起流式抗體具體要怎么選，估計很多小伙伴都會犯難，實驗前需要考慮的是流式抗體的選擇和熒光素的搭配，那么接下來就給大家分享一下在選擇流式抗體時有哪些注意事項吧。
選流式抗體需注意哪些問題?
1、抗體的基本要求
a. 清楚知道待測靶標(biāo)是胞內(nèi)還是胞外蛋白;
b. 嚴(yán)格按照樣品來源選擇抗體反應(yīng)性;
c. 必須選擇明確標(biāo)注可用于流式實驗的抗體，不能用普通抗體代替。
2、流式細(xì)胞儀的要求
a.了解所用的流式細(xì)胞儀有幾個激光器，常見的激光器有405nm、488nm和633nm等，目前大部分的流式細(xì)胞儀都配有488nm和633nm2個激光器;
b. 知道每個激光器下有幾個檢測通道，通道數(shù)決定一次多測多少個指標(biāo);
3、熒光標(biāo)記的選擇
a. 有直標(biāo)抗體的話，盡量選直標(biāo)，間接標(biāo)記二抗增加實驗步驟，多次清洗造成會細(xì)胞損失，染色準(zhǔn)確性也低;
b. 弱表達(dá)靶標(biāo)，盡量選擇強(qiáng)熒光素標(biāo)記抗體，PE>APC>FITC>PerCP。
4、多色搭配方案
a. 每個通道只能用一種標(biāo)記，如FITC和AF488，兩種標(biāo)記的激發(fā)波長和發(fā)射波長均相近，所以不能同時用這兩種標(biāo)記;
b. 盡量減少光譜重疊，如PE-cy5和APC，兩者同用時調(diào)補(bǔ)償值過大;
c. 弱靶標(biāo)配強(qiáng)熒光素，如Treg細(xì)胞中CD4表達(dá)量高于FoxP3，所以FoxP3應(yīng)使用強(qiáng)熒光素標(biāo)記抗體;
d. 五色及以上配色建議查閱文獻(xiàn)，或者咨詢抗體廠商。
5、如何調(diào)補(bǔ)償?
多色流式實驗，由于各個熒光素存在光譜的重疊，因此需要進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)，在550nm附近，兩種染料存在光譜重疊。
下圖為CD3-FITC，CD4-PE的染色補(bǔ)償調(diào)節(jié)過程，調(diào)補(bǔ)償簡單的一個詞就是：“橫平豎直”，慢慢理解哦!
6、同型對照?
同型對照的目的是為了減少背景干擾，更好展現(xiàn)抗原與抗體的結(jié)合強(qiáng)度，尤其對于一些胞內(nèi)蛋白、低表達(dá)或連續(xù)表達(dá)蛋白，同型對照的設(shè)置顯得尤為必要。同型對照需要選擇與染色的單克隆抗體相同種屬來源，相同抗體亞型，相同熒光標(biāo)記的抗體。
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