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Illumina測(cè)序原理
閱讀：276發(fā)布時(shí)間：2025-2-13
Illumina測(cè)序是一種基于邊合成邊測(cè)序（Sequencing by Synthesis，SBS）的高通量測(cè)序技術(shù)，其原理主要包括以下幾個(gè)步驟：
1. 文庫(kù)制備
片段化：將待測(cè)DNA片段通過(guò)酶切、超聲波打斷等方法隨機(jī)打碎成200~800bp的片段。
末端修復(fù)與接頭連接：對(duì)隨機(jī)打斷的雙鏈DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，使其兩端平齊，并在兩端連接上特異性接頭序列。
PCR擴(kuò)增：對(duì)連接了接頭的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以增加DNA片段的數(shù)量。
2. 簇生成（Cluster Generation）
流動(dòng)槽（Flow Cell）雜交：流動(dòng)槽表面固定有與接頭互補(bǔ)的寡核苷酸片段，將文庫(kù)DNA片段與流動(dòng)槽表面的寡核苷酸片段雜交。
橋式PCR擴(kuò)增：通過(guò)橋式PCR擴(kuò)增，將單拷貝DNA分子擴(kuò)增成簇，形成數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA簇。每個(gè)簇包含數(shù)千個(gè)相同的DNA分子，便于光學(xué)成像系統(tǒng)捕捉熒光信號(hào)。
3. 測(cè)序
邊合成邊測(cè)序：向反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶、接頭引物和帶有熒光標(biāo)記的4種dNTP。這些dNTP的3’端羥基被化學(xué)方法保護(hù)，每次只能添加一個(gè)dNTP。
熒光信號(hào)檢測(cè)：在dNTP被添加到合成鏈上后，洗脫未使用的dNTP和DNA聚合酶，加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，并由光學(xué)設(shè)備記錄熒光信號(hào)。
信號(hào)處理與循環(huán)：將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為堿基序列信息，然后加入化學(xué)試劑猝滅熒光信號(hào)并去除dNTP 3’端羥基保護(hù)基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測(cè)序反應(yīng)。
4. 數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)處理：將測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)百萬(wàn)個(gè)reads進(jìn)行處理，通過(guò)在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中引入的獨(dú)·特index分離不同樣本的序列。
序列拼接與比對(duì)：將正向和反向reads配對(duì)，生成連續(xù)序列，并與參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析。
Illumina測(cè)序技術(shù)因其高通量、低成本、高準(zhǔn)確度等優(yōu)勢(shì)，成為目前應(yīng)用最·廣泛的二代測(cè)序平臺(tái)。
測(cè)序產(chǎn)品推薦：
MS-102-3003 MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle)基因測(cè)序試劑盒
MS-102-2002 MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)基因測(cè)序試劑盒
MS-102-2003 Miseg Reagent Kit v2（500-cycles）基因測(cè)序試劑盒
FC-420-1004 MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)基因測(cè)序試劑盒
20040560 NextSeq 2000 P3 Reagents (200 Cycles) 試劑盒
20040561 NextSeq 2000 P3 Reagents (300 Cycles) 試劑盒
MS-102-3001 MiSeq Reagent Kit v3 (150-cycle)基因測(cè)序試劑盒
20024907 NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) 試劑盒
MS-103-1003 MiSeq Reagent Nano Kit v2 MiSeq V2基因測(cè)序試劑盒
20028319 NovaSeq 6000 S1 Reagent Kit v1.5 (100 cycles)試劑盒
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