產(chǎn)品訂購信息

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Qiagen 150343 REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒產(chǎn)品歡迎您致電 華雅再生醫(yī)學(xué)旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司 ：152 1681 4001。華雅再生醫(yī)學(xué)-客服: 316 808 6348。

產(chǎn)品原理

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒采用多重置換擴(kuò)增（MDA，Multiple Displacement Amplification）技術(shù)，對(duì)所有基因組位點(diǎn)進(jìn)行無偏差的擴(kuò)增。與基于PCR的全基因組擴(kuò)增技術(shù)相比，該技術(shù)具有更好的擴(kuò)增保真度，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性信號(hào)。

儲(chǔ)存條件：-20°C

質(zhì)控

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒所有緩沖液和試劑生產(chǎn)都經(jīng)過嚴(yán)格控制的流程，避免污染DNA，確保每次實(shí)驗(yàn)獲得可靠的結(jié)果。

安全信息

使用REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒時(shí)，穿戴合適的實(shí)驗(yàn)防護(hù)服，一次性手套和保護(hù)手套。詳細(xì)信息，參見SDS。

適用樣本

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒可使用各種臨床和非臨床研究樣品，包括已純化的基因組 DNA（gDNA）、新鮮或干燥的血液，以及新鮮或冷凍的組織。REPLI-g Single Cell 擴(kuò)增后DNA 產(chǎn)物平均長度 >10 kb，且完整覆蓋基因組，高度適合也已經(jīng)開發(fā)用于新一代測(cè)序（NGS）、芯片法比較基因組雜交（array CGH）或 qPCR 分析。

應(yīng)用

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒適用于分子生物學(xué)應(yīng)用。該產(chǎn)品不適用于疾病的診斷、預(yù)防或治療。推薦依據(jù)NIH發(fā)布的重組DNA實(shí)驗(yàn)指南或其他指南使用所有Qiagen產(chǎn)品。

更詳細(xì)應(yīng)用領(lǐng)域：

人 / 動(dòng)物：生物標(biāo)志物研究（SNP、突變、CNV），干細(xì)胞研究，循環(huán)胎兒細(xì)胞的分析（產(chǎn)前檢測(cè)篩查），嵌合研究，遺傳易感性研究，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分型。

癌癥：體細(xì)胞遺傳變異分析，腫瘤發(fā)展，腫瘤干細(xì)胞 / 進(jìn)化，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的分析

細(xì)菌：宏基因組學(xué) (Metagenomics)，研究病原體分析，微生物基因分型。

植物 * ：氣孔研究，花粉分析。

* 無細(xì)胞壁的細(xì)胞或已純化的基因組 DNA。

下游應(yīng)用及儀器

全基因組測(cè)序、外顯子組測(cè)序：新一代測(cè)序平臺(tái) †（Illumina等）

SNP 基因分型芯片、Array CGH：芯片平臺(tái) †

qPCR/PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)定量 PCR/PCR 循環(huán)儀 †

Sanger 測(cè)序：毛細(xì)管測(cè)序儀 †

焦磷酸測(cè)序：PyroMark®（QIAGEN）

† 多個(gè)供應(yīng)商

例：全基因組測(cè)序流程

細(xì)胞樣本/基因組DNA——樣本處理——REPLI-g Single Cell Kit擴(kuò)增——新一代測(cè)序

組份規(guī)格

需要用戶自備材料

微離心管

水浴或其他加熱儀器

微型離心機(jī)

漩渦混合儀（Vortexer）

吸管和吸頭

冰

操作方法選擇

REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒需要根據(jù)起始樣本選擇對(duì)應(yīng)操作方法

其他起始樣本：血漿血清、活檢、需要高通量擴(kuò)增的樣本等參見其他對(duì)應(yīng)說明書。

操作流程

方法*程

細(xì)胞樣本——加入變性混合液——65°C孵育10min——加入終止液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴(kuò)增DNA

方法二流程

純化基因組DNA——加入變性混合液——15-25°C孵育3min——加入neutralization混合液——加入Master混合液——30°C孵育8h，65°C 終止3min——獲得擴(kuò)增DNA

方法一：從單細(xì)胞擴(kuò)增基因組DNA

實(shí)驗(yàn)開始前注意事項(xiàng)

1.適用樣本：1-1000個(gè)完整細(xì)胞

這個(gè)方法適用于所有物種的單細(xì)胞樣本，如：脊椎動(dòng)物，細(xì)菌（革蘭氏陽性菌和陰性菌），植物（細(xì)胞壁已脫），分選細(xì)胞，組織培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞。

不適用樣本：福爾馬林固定樣本或其他使用交聯(lián)劑固定的樣本，如：從福爾馬林固定石蠟包埋組織中激光顯微切割得到的單細(xì)胞樣本。

2.小心試劑不要被外源DNA污染。如：使用干凈獨(dú)立吸頭吸管，在無外源DNA地方進(jìn)行反應(yīng)操作。

3.純化基因組DNA擴(kuò)增參見方法二。

4.聚合酶要在冰上解凍（見步驟6）。其他成分可以室溫解凍（15–25°C）。

5.配制的D2緩沖液（變性緩沖液）存放不要超過3個(gè)月。

6.陰性對(duì)照（無模板）的DNA產(chǎn)量約 40 µg。因?yàn)?/span>REPLI-g 的單細(xì)胞擴(kuò)增反應(yīng)中，引物二聚體的隨機(jī)擴(kuò)增得到高分子量的DNA產(chǎn)物。這一DNA不會(huì)影響實(shí)際樣本質(zhì)量，也不會(huì)影響下游分析造成陽性結(jié)果。

開始前準(zhǔn)備

試劑預(yù)處理

1.DLB緩沖液加500µl試劑盒的水混勻，稍微離心溶解。

注意：重組的DLB緩沖液–20°C能放6個(gè)月。

Buffer DLB is pH-labile.

2.所有緩沖液和試劑使用前都要用漩渦混合器充分混勻。

儀器預(yù)設(shè)

3.水浴，heating block或熱循環(huán)儀溫度設(shè)為30°C。

如果熱循環(huán)儀帶加熱蓋，蓋子溫度設(shè)為70°C。

步驟

一 變性

1.按表1配制足量（整個(gè)擴(kuò)增流程所需）D2緩沖液（變性緩沖液）。

注意：表中提供的D2緩沖液用量足夠進(jìn)行12次反應(yīng)。沒用完的D2緩沖液–20°C 存放，但不要存放超過3個(gè)月。

表1.D2緩沖液配制

2. 4 µl樣本細(xì)胞（含PBS）加入微離心管。如果細(xì)胞不夠4 µl，加PBS sc補(bǔ)齊。

注意：REPLI-g單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒提供的PBS sc量不夠用于樣本細(xì)胞的連續(xù)稀釋。

可以使用0.5 µl 全血。（Alternatively, 0.5 µl whole blood can be used.）

3.加入3 µl 配制的D2緩沖液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。

注意：確保樣本細(xì)胞沒有貼在緩沖液線上的管壁。

4.65°C孵育10min。

1. 加入3 µl 終止液。小心輕彈試管混勻，稍微離心。冰上保存。

二 擴(kuò)增

6.冰上解凍REPLI-g sc DNA聚合酶。其他成分室溫解凍，漩渦振蕩后稍微離心。

解凍后REPLI-g sc反應(yīng)緩沖液可能會(huì)形成沉淀，漩渦振蕩10s可以溶解沉淀。

7.按表2配制master混合液?；靹?，稍微離心。

要點(diǎn)：嚴(yán)格按照表2所列順序配制。加入水和反應(yīng)緩沖液后，稍微漩渦振蕩和離心后再加入DNA聚合酶。

注意：一次性進(jìn)行多次反應(yīng)時(shí)，根據(jù)反應(yīng)數(shù)量等比例增加用量。DNA聚合酶加好后maste混合液要立即投入使用。

表2：master混合液配制

多次反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)數(shù)量等比例增加劑量并增加10%。

8.每次反應(yīng)，10 µl 變性DNA（步驟5）加入40 µl master 混合液。

9.30°C孵育8h。

30°C孵育后，水浴或其他加熱儀可以改設(shè)為65°C方便步驟10使用。

注意：如果使用帶加熱蓋的熱循環(huán)儀，蓋子溫度設(shè)為70°C。

10.DNA聚合酶65°C滅活3min。

擴(kuò)增產(chǎn)物儲(chǔ)存

11.如果不直接使用，擴(kuò)增所得DNA 短期儲(chǔ)存在4°C，長期儲(chǔ)存在–20°C。

使用REPLI-g Single Cell Kit 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒的DNA可以當(dāng)作基因組DNA（zui低凍融循環(huán)），因此推薦zui低核酸儲(chǔ)存密度為100 ng/µl。

注意：避免多次反復(fù)凍融以確保DNA質(zhì)量。

下游應(yīng)用樣本處理

12.依照說明書用水或TE適量稀釋擴(kuò)增DNA。用于PCR分析的擴(kuò)增DNA按1:100稀釋，每次PCR反應(yīng)使用2 µl 稀釋后DNA。

13.擴(kuò)增DNA可用于一系列下游應(yīng)用，包括：第二代測(cè)序，array CGH和定量PCR。

注意：每50 µl典型反應(yīng)的DNA產(chǎn)量約40 µg，需要正確稀釋。擴(kuò)增DNA定量見附件A。

方法二：純化基因組DNA擴(kuò)增

略。詳情參見原版說明書。中文版翻譯可咨詢紅榮微再。

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英文版說明書節(jié)選——方法一步驟：從單細(xì)胞擴(kuò)增基因組DNA

Protocol: Amplification of Genomic DNA from Single Cells

Procedure步驟

1. Prepare sufficient Buffer D2 (denaturation buffer) for the total number of whole genome amplification reactions (Table 4).

Note: The total volume of Buffer D2 given in Table 4 is sufficient for 12 reactions. If performing fewer reactions, store residual Buffer D2 at –20°C. 

Buffer D2 should not be stored longer than 3 months.

2. Place 4 µl cell material (supplied with PBS) into a microcentrifuge tube. If using less than 4 µl of cell material, add PBS sc to bring the volume up to 4 µl.

Note: The amount of PBS sc supplied with the REPLI-g Single Cell Kit is insufficient to prepare serial dilutions of cell material.

Alternatively, 0.5 µl whole blood can be used.

3. Add 3 µl Buffer D2. Mix carefully by flicking the tube and centrifuge briefly.

Note: Ensure that the cell material does not stick to the tube wall above the buffer line.

4. Incubate for 10 min at 65°C.

5. Add 3 µl Stop Solution. Mix carefully by flicking the tube and centrifuge briefly. Store on ice.

6. Thaw REPLI-g sc DNA Polymerase on ice. Thaw all other components at room temperature, vortex, then centrifuge briefly.

The REPLI-g sc Reaction Buffer may form a precipitate after thawing. The precipitate will dissolve by vortexing for 10 s.

7. Prepare a master mix according Table 5. Mix and centrifuge briefly.

IMPORTANT: Add the master mix components in the order listed in Table

4. After the addition of water and REPLI-g sc Reaction Buffer, briefly vortex and centrifuge the mixture before adding REPLI-g sc DNA Polymerase. 

Note: Scale up accordingly if performing several reactions at once by preparing a master mix sufficient for the total number of reactions. The master mix should be kept on ice and used immediay upon addition of REPLI-g sc DNA Polymerase.

8. For each reaction, add 40 µl master mix to 10 µl denatured DNA (from step 5).

9. Incubate at 30°C for 8 h.

After incubation at 30°C, heat the water bath or heating block up to 65°C if the same water bath or heating block will be used in step 10.

Note: If a thermal cycler is used with a heated lid, the temperature of the lid should be set to 70°C.

10. Inactivate REPLI-g sc DNA Polymerase at 65°C for 3 min.

11. If not being used directly, store amplified DNA at 4°C for short-term storage or –20°C for long-term storage.

DNA amplified using the REPLI-g Single Cell Kit should be treated as genomic DNA with minimal freeze-thaw cycles. We therefore recommend storage of nucleic acids at a concentration of at least 100 ng/µl.

12. Use the correct amount of REPLI-g amplified DNA diluted in water or TE according to the manufacturer’s instructions. If performing PCR analysis, dilute an aliquot of amplified DNA 1:100 and use 2 µl of diluted DNA for each PCR reaction.

Note: If bacterial cells have been used as target material for REPLI-g Single Cell Kit, dilute the amplified DNA at least 1:10,000.

13. Amplified DNA can be used in a variety of downstream applications,including next-generation sequencing, array CGH, and quantitative PCR.

Note: Typical DNA yields are approximay 40 µg per 50 µl reaction and need to be diluted appropriay. Optical density (OD) measurements overestimate REPLI-g amplified DNA. Refer to Appendix A, page 21, for an accurate method of quantifying REPLI-g amplified DNA.

參考文獻(xiàn)

1. Dean, F.B. et al (2002) Comprehensive human genome amplification using

multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5261.

2. Hosono, S. et al (2003) Unbiased whole-genome amplification directly from

clinical samples. Genome Res. 13, 954.

3. Yan, J., Feng, J., Hosono, S., Sommer, S.S. (2004) Assessment of multiple

displacement amplification in molecular epidemiology. Biotechniques 37,

136.

Qiagen 150343 REPLI-g Single Cell Kit 產(chǎn)品信息由紅榮微再翻譯整理。

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