產(chǎn)品英文名：TAKARA RetroNectin®(Recombinant Human Fibronectin Fragment)，F(xiàn)N CH-296

產(chǎn)品中文名：TAKARA RetroNectin®重組人纖維蛋白片段，F(xiàn)N CH-296

RetroNectin® 重組人纖維蛋白片段

RetroNectin^®是在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組人纖維蛋白片段FN CH-296。 當(dāng)包被在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板表面時(shí)，RetroNectin^®能顯著增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。

RetroNectin^®重組人纖維蛋白片段和激發(fā)型CD3單抗可分別與T淋巴細(xì)胞上的VLA和TCR結(jié)合，兩者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，通過(guò)Ras途徑刺激T細(xì)胞的增殖和分化，使其獲得上千倍的增殖。

組份

RetroNectin (Recombinant Human Fibronectin Fragment)  0.5 mg (Cat. #T100A)

RetroNectin (Recombinant Human Fibronectin Fragment)  2.5 mg (Cat. #T100B)

RetroNectin is provided as a sterile 1 mg/ml solution.

[Form]　Sterile solution containing 12.5 mM sodium citrate (pH 6.2) and 1.25% sucrose

儲(chǔ)存

-20℃

Caution:  Freezing and thawing can be repeated up to 10 times

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訂購(gòu)RetroNectin歡迎您咨詢華雅再生醫(yī)學(xué)旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司 。紅榮微再*代理TAKARA CellArtis ，Rubicon產(chǎn)品。紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司以“傳遞科學(xué)價(jià)值，服務(wù)科學(xué)研究”為宗旨，主營(yíng)干細(xì)胞、精準(zhǔn)醫(yī)療、細(xì)胞治療、器官再生四大板塊的產(chǎn)品。

RetroNectin原理

RetroNectin是重組人纖維蛋白片段FN CH-296，包括細(xì)胞結(jié)合域，肝磷脂結(jié)合域和CS1位點(diǎn)三個(gè)功能區(qū)域。它由574個(gè)氨基酸組成，分子量63 kDa。RetroNectin能夠大幅地提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的感染效率，其作用原理是：細(xì)胞表面VLA-4及VLA-5可分別與RetroNectin上的CS-1位點(diǎn)及細(xì)胞結(jié)合域結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以與肝磷脂結(jié)合域結(jié)合。在經(jīng)RetroNectin包被的培養(yǎng)容器表面，細(xì)胞與病毒載體以高濃度共存，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率。RetroNectin^®重組人纖維蛋白片段和激發(fā)型CD3單抗可分別與T淋巴細(xì)胞上的VLA和TCR結(jié)合，兩者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，通過(guò)Ras途徑刺激T細(xì)胞的增殖和分化，使其獲得上千倍的增殖。

RetroNectin逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)操作流程

RetroNectin技術(shù)可以顯著提高逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染效率，這一發(fā)現(xiàn)克服了向造血干細(xì)胞中導(dǎo)入基因的困難。現(xiàn)在，RetroNectin技術(shù)已成為使用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的常規(guī)選擇，其操作流程大致如下：

1. 注射用水或滅菌蒸餾水充分溶解RetroNectin，調(diào)節(jié)濃度至1mg/ml。

2. 0.22 μm濾膜過(guò)濾RetroNectin溶液，分裝后-20 ℃保存。

3. 用緩沖液將RetroNectin溶液稀釋至20～100 μg/ml。

4. 將RetroNectin稀釋液加入24孔板，每孔0.5 ml (建議用PBS緩沖液稀釋RetroNectin后包被Non-Tissue Cluture Treated plate。

5. 室溫放置4小時(shí)或4 ℃，避光，過(guò)夜。

6. 吸出RetroNectin溶液，每孔加入PBS終止液0.5 ml。

7. 室溫放置30分鐘。

8. 加入適量PBS清洗孔板。

9. 吸出清洗液，得到RetroNectin包被的孔板 (如果暫不使用，可以在孔中加入適量PBS，用膠膜將平板蓋密封，避免RetroNectin干燥，可于4 ℃保存4周。使用前將PBS吸出) 。

10. 逆轉(zhuǎn)錄病毒保存液 (-80 ℃) 于37 ℃水浴融解。

11. 將病毒液加入包被后的24孔板，每孔300 μl。

12. 32 ℃放置4小時(shí)。

13. 吸出病毒保存液。

14. 每孔加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸液400 μl (通常細(xì)胞濃度為1 × 105/ml) 。

RetroNectin增強(qiáng)T細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)流程

T-cell expansion protocol using RetroNectin reagent, GT-T551 T-cell medium, CultiLife bags, and anti-CD3 mAb.

1.  RetroNectin和CD3單克隆抗體包被培養(yǎng)袋。

2.  同時(shí)，來(lái)自PBMC的T細(xì)胞用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。

3.  第4天，T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋，繼續(xù)用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。

4.  第7天，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。

5.  第10天，分裝兩個(gè)培養(yǎng)袋，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。

PBMCs and autologous plasma were prepared using 50 ml of blood from two healthy volunteers with informed consent. PBMCs from each donor were split into two samples to test anti-CD3-antibody- and IL-2-induced expansion with or without RetroNectin reagent (RN). CultiLife 215 bags (CultiLife 215 Culture Bag, Cat. No. FU0005) were coated with either anti-CD3 antibody plus RN or anti-CD3 antibody alone in PBS for 2 hr, then rinsed three times with PBS. On Day 0, PBMCs were resuspended in 50 ml of GT-T551 medium supplemented with heat-inactivated plasma (0.6% final volume) and added to the coated CultiLife 215 bags. Additional GT-T551 medium supplemented with IL-2 and plasma was added to each CultiLife 215 bag to reach a final volume of 250 ml. The PBMCs were transferred to CultiLife Eva bags (GT-T610 [CultiLife Eva] Culture Bag, Cat. No. FU0010) on Day 4 and fresh GT-T551 medium (with IL-2 and 0.6% inactivated plasma) was added to bring the volume to 500 ml per bag. An additional 500 ml of medium supplemented with only IL-2 was added on Day 7. On Day 10, cells were split into two CultiLife Eva bags, with fresh medium and IL-2 added to bring the final volume of each bag to 1,000 ml. The cells were harvested on Day 14, the total number of T cells was counted, and the proportion of naïve (CD45RA+/CCR7+) T cells was determined by flow cytometry analysis.

PBMC：人外周血單個(gè)核細(xì)胞

參考文獻(xiàn)

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[8]任瑋,王志華.重組人纖維蛋白片段誘導(dǎo)CIK的增殖及對(duì)肺癌耐順鉑細(xì)胞的殺傷作用[J].生物工程學(xué)報(bào),2008(08):1373-1380.

[9]楊建民,Michael S Friedman,李嶠,James J Mule,Alfred E Chang,Kevin T McDonagh.轉(zhuǎn)染嵌合性T細(xì)胞受體基因小鼠T淋巴細(xì)胞的體外抗腫瘤作用[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2006(04):243-248.

文獻(xiàn)簡(jiǎn)述

Retronectin重組人纖維蛋白除了提高逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染效率，還能在CD3單克隆抗體的協(xié)作下，刺激T細(xì)胞、CIK細(xì)胞和RAK細(xì)胞等的擴(kuò)增。

Information: T-cell expansion by RetroNectin stimulation RetroNectin reagent has been widely used to enhance retroviral and lentiviral gene transfer into mammalian cells.

In addition, RetroNectin reagent enhances the proliferation of T lymphocytes. T cells are conventionally expanded in the presence of Interleukin-2 (IL-2) by stimulation with anti-CD3 antibody. The addition of RetroNectin in this stimulation step dramatically increases the efficiency of T cell expansion. In addition, T cells expanded with this method contain a high proportion of less-differentiated T cells (naive T cells). Naive T cells have the ability to differentiate into cytotoxic T cells in vivo.

[1] 張慧穎. RetroNectin活化的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療晚期原發(fā)性肝癌的臨床研究[D].鄭州大學(xué),2014.

研究發(fā)現(xiàn)，重組人纖維蛋白（RetroNectin-RN）聯(lián)合抗CD3單克隆抗體體外包被培養(yǎng)和擴(kuò)增CIK細(xì)胞時(shí)可以使CD3Ab與T細(xì)胞的接觸和黏附進(jìn)一步增加，不僅可以縮短細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，而且可進(jìn)一步提高細(xì)胞的培養(yǎng)效率并避免CIK細(xì)胞殺傷活性的降低。

關(guān)鍵詞：晚期原發(fā)性肝癌; RetroNectin; CIK; 臨床研究;

[2] 任瑋,王志華.重組人纖維蛋白片段誘導(dǎo)CIK的增殖及對(duì)肺癌耐順鉑細(xì)胞的殺傷作用[J].生物工程學(xué)報(bào),2008(08):1373-1380.

Retronectin重組人纖維蛋白對(duì)CIK細(xì)胞有很強(qiáng)的激活作用,可使其細(xì)胞增殖總數(shù)達(dá)524.77倍,其主要效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+可達(dá)(31.40±1.91)%;對(duì)肺癌耐順鉑細(xì)胞DDP-A549的殺傷作用明顯高于其親代藥物敏感株A549(P<0.01)。但兩組CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率在相同效靶比時(shí)無(wú)明顯差異(P>0.05)。RetroNectin能顯著增強(qiáng)CIK增殖活性,但對(duì)CIK細(xì)胞的殺傷活性并無(wú)明顯影響。CIK能夠顯著抑制DDP-A549的生長(zhǎng),可用于耐順鉑肺腺癌的免疫治療。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞; RetroNectin; 增殖; 肺癌細(xì)胞; 殺傷活性;

[3] 韓穎,于津浦,李慧,曹水,任寶柱,齊靜,安秀梅,張廼寧,任秀寶,郝希山.重組人纖維蛋白片段對(duì)CIK細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制研究[J].中國(guó)腫瘤臨床,2010,37(02):71-75.

重組人纖維蛋白片段（RetroNectin）能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期,抵抗凋亡而促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能為RetroNectin與CIK細(xì)胞上VLA-4及VLA-5兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而通過(guò)Vav1蛋白作為第二信號(hào)活化T細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：重組人纖維蛋白片段; CIK細(xì)胞; Vavl;

[4] 張興華. 剔除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增強(qiáng)RAK過(guò)繼免疫治療機(jī)制的研究[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2011.

Retronectin重組人纖維蛋白和CD3mAb聯(lián)用所培養(yǎng)獲得RAK細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力,培養(yǎng)后細(xì)胞表型絕大多數(shù)是CD3+CD8+T細(xì)胞。在RAK細(xì)胞培養(yǎng)前加以調(diào)節(jié)性T細(xì)胞剔除的步驟,能夠在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步放大細(xì)胞增殖和殺傷能力。

關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞; 過(guò)繼免疫治療; Retronectin;

[5] 張興華,袁偉,趙晨,馬潔,趙平.R etronectin和CD3mAb聯(lián)合培養(yǎng)CD56~+細(xì)胞用于治療胰腺癌的研究[J].實(shí)用腫瘤雜志,2011,26(02):113-118.

CD3mAb和Retronectin重組人纖維蛋白聯(lián)合培養(yǎng)CD56+細(xì)胞的方法能夠提高細(xì)胞的增殖效率和殺傷活性,具有良好的臨床細(xì)胞治療應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：胰腺腫瘤/治療; 殺傷細(xì)胞,天然; 免疫療法,過(guò)繼; 細(xì)胞,培養(yǎng)的; 重組融合蛋白質(zhì)類; 單核細(xì)胞/免疫學(xué);

[6] 尹健. 外周造血干細(xì)胞純化、體外擴(kuò)增及多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究[D].天津醫(yī)科大學(xué),2003.

利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體將多藥耐藥基因?qū)朐煅杉?xì)胞，在轉(zhuǎn)染中予細(xì)胞因子支持，并利用Retronectin重組人纖維蛋白以提高轉(zhuǎn)染效率。在SCF+IL一3+FL+TPO+EPO的支持下，利用Retronectin重組人纖維蛋白可以使逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的多藥耐藥基因的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到20%，基本滿足了臨床治療的需要。

關(guān)鍵詞：外周造血干細(xì)胞; 純化; 擴(kuò)增; 多藥耐藥基因;

[7] 楊建民,Michael S Friedman,李嶠,James J Mule,Alfred E Chang,Kevin T McDonagh.轉(zhuǎn)染嵌合性T細(xì)胞受體基因小鼠T淋巴細(xì)胞的體外抗腫瘤作用[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2006(04):243-248.

Retronectin重組人纖維蛋白結(jié)合離心法轉(zhuǎn)染經(jīng)抗CD3/CD28單抗活化的小鼠T淋巴細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率可達(dá)50%以上。轉(zhuǎn)染嵌合性T細(xì)胞受體基因的小鼠T淋巴細(xì)胞在體外可通過(guò)細(xì)胞因子釋放和CTL效應(yīng)發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用。

關(guān)鍵詞：嵌合性T細(xì)胞受體; 基因轉(zhuǎn)染; 免疫治療; 小鼠; T淋巴細(xì)胞;

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