Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品描述
Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒為Annexin V與PI聯(lián)合使用的試劑盒，用于檢測細胞凋亡早期的發(fā)生，可區(qū)分凋亡早期凋亡細胞和晚期凋亡或壞死細胞。
Annexin V為胞內(nèi)蛋白膜聯(lián)蛋白家族成員，以鈣離子依賴的方式選擇性與磷脂酰絲*酸(PS)結(jié)合。PS正常分布在細胞膜內(nèi)側(cè)。PS外翻到細胞膜外是不同類型的細胞在凋亡早期的明顯特征，用帶有FITC標記的Annexin V，即Annexin V-FITC，可通過流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測到這一重要特征。FITC呈現(xiàn)黃綠色熒光。
PI（Propidium Iodide, 碘化丙啶）是一種可對 DNA 染色的細胞核染色試劑，在嵌入DNA 后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細胞膜，但可以穿透壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞。
Annexin V-FITC與PI聯(lián)合使用時，PI 被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被 FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。
FITC最大吸收波長和激發(fā)波長分別為494nm和518 nm，PI-DNA復合物的最大吸收和發(fā)射波長分別為535 nm和617 nm。
訂購信息

產(chǎn)品組分

運輸與保存
藍冰運輸。4℃避光保存，有效期18個月。【注】：不可冷凍。
使用方法
下列實驗方案以利用星形孢菌素誘導 Jurkat 細胞凋亡為例，如果使用其他誘導劑和其他類型的細胞，實驗條件需要略作調(diào)整。
1.流式細胞檢測

1. 根據(jù)實驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經(jīng)處理的細胞樣品，作為陰性對照。此外，建議設定一組樣品做（Annexin V-FITC或PI）單染，用于調(diào)節(jié)補償。

2. 收集細胞。

懸浮細胞：300 g，4℃離心 5 min 收集細胞；
貼壁細胞：用不含 EDTA 的胰*消化后 300 g，4℃離心 5 min收集細胞，胰*消化時間不宜過長，以防引起假陽性。【注】：用胰蛋*酶消化然后使細胞在最佳細胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復約30 min，然后再染色。胰*白酶消化會暫時破壞質(zhì)膜，允許Annexin V-FITC結(jié)合磷脂酰絲*酸在細胞膜的細胞質(zhì)表面上，從而導致假陽性染色。

3. 用預冷的 PBS 洗滌細胞兩次，每次均在 300 g，4℃ 下離心 5 min，收集 1-5×10⁵ 個細胞并用 100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞。

4. 每管加入 4-5 μL 的 Annexin V-FITC 和 5 μL 的 PI工作液。【注】：推薦準備兩管額外的流式管，每管只加入一種單染染料（Annexin V-FITC或PI），用于流式單染的補償調(diào)節(jié)。

5. 室溫避光孵育 10-15 min，為避免細胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作。

6. 每管加入 400 μL 的 PBS 或 1×結(jié)合緩沖液，盡快通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。Annexin V-FITC 可以由 488nm 激光激發(fā)，檢測熒光發(fā)射光譜約在 530 nm 處（FITC 通道），PI 通道發(fā)射光譜約在 617 nm 處?！咀ⅰ浚篜BS 或 1×結(jié)合緩沖液的選擇根據(jù)不同凋亡處理以及不同細胞具體選擇。

2.熒光顯微鏡檢測
對于懸浮細胞，可參照流式細胞檢測的方法進行具體操作。

1. 在蓋玻片或載玻片小室中接種細胞。

2. 根據(jù)實驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經(jīng)處理的細胞樣品，作為陰性對照。

3. 用 PBS 洗滌細胞?！咀ⅰ浚?/span>細胞收集后如果不用 PBS 清洗，可以用含血清的培養(yǎng)基直接替代Annexin V 結(jié)合緩沖液，但是 Annexin V 的使用濃度需要重新優(yōu)化。

4. 每 100 μL 的 Annexin V 結(jié)合緩沖液中加入 5-25 μL 的 Annexin V-FITC 和 5 μL 的 PI。【注】：最佳使用濃度由具體實驗要求確定。

5. 向培養(yǎng)板中加入足量的染液以覆蓋全部細胞，室溫避光孵育 15-30 min。為避免細胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時間至少延長至 30 min。

6. 用 1×結(jié)合緩沖液清洗細胞。

7. 將孵育有細胞的蓋玻片置于載玻片上，載玻片可提前加一滴 1×結(jié)合緩沖液；對于培養(yǎng)在小室內(nèi)的細胞，可直接加入足量的 1×結(jié)合緩沖液覆蓋細胞。

8. 使用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀察細胞。Annexin V-FITC 可用 FITC 適用的濾光片，PI 可用 Cy3 或者 Texas。

注意事項

1. 本產(chǎn)品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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