從北京到世界: CHO細(xì)胞的“中國(guó)往事”

 2018-03-26  細(xì)胞摩天輪  上海蒂科生物科技有限公司   

*，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞是生產(chǎn)蛋白類藥物的宿主細(xì)胞，因?yàn)榕c其他系統(tǒng)相比，CHO細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：①CHO 細(xì)胞對(duì)蛋白有準(zhǔn)確的加工、修飾功能，因此其表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白；②CHO細(xì)胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對(duì)較強(qiáng)，可根據(jù)培養(yǎng)要求選擇可貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的方式；③整合外源基因后的細(xì)胞穩(wěn)定，重組基因能擴(kuò)增和表達(dá)；④表達(dá)的目的蛋白可由細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，并且CHO細(xì)胞只表達(dá)少量的內(nèi)源蛋白，有利于目的蛋白的提取。如今，市場(chǎng)上一半以上zui為的生物制劑是由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的。如，阿達(dá)木單抗（Humira）、貝伐單抗（Avastin）和利妥昔單抗（Rituxan）?？梢哉f(shuō)，CHO細(xì)胞對(duì)現(xiàn)代生物藥工業(yè)發(fā)展做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)。不過(guò)你是否知道CHO細(xì)胞zui早的歷史？今天，讓我們簡(jiǎn)單梳理一下CHO細(xì)胞的前世今生，了解一下CHO細(xì)胞背后的故事，或許可以給我們未來(lái)的工作更多啟發(fā)和思考。

中國(guó)倉(cāng)鼠（學(xué)名 Cricetulus griseus）屬于來(lái)自于中國(guó)北部和蒙古地區(qū)的嚙齒動(dòng)物家族。1919年，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的胡正祥教授（注：胡正祥，1896年生，病理學(xué)家。1921年畢業(yè)于美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院，后在美國(guó)麻省總醫(yī)院繼續(xù)學(xué)習(xí)病理學(xué)5年。回國(guó)后歷任北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院副院長(zhǎng)，病理系教授、系主任等職，在病理學(xué)研究中頗有建樹(shù)。）zui早在北京使用中國(guó)地倉(cāng)鼠研究肺炎球菌，由于條件所限，試驗(yàn)小白鼠很難獲得，正好北京周圍的中國(guó)地倉(cāng)鼠眾多，中國(guó)地倉(cāng)鼠便成為了很好的試驗(yàn)研究工具。后來(lái)在北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院工作的美國(guó)科學(xué)家Jocelyn Smyly和Charles Young發(fā)現(xiàn)中國(guó)地倉(cāng)鼠很容易感染寄生蟲(chóng)利什曼原蟲(chóng)從而引發(fā)Black fever黑熱病，之后中國(guó)的醫(yī)學(xué)科研人員都使用中國(guó)地倉(cāng)鼠來(lái)研究各種傳染性疾病，中國(guó)倉(cāng)鼠成為了流行病學(xué)研究的有力工具。

1948年12月，南京解放前的一個(gè)黑暗的深夜，美國(guó)洛克菲勒基金會(huì)醫(yī)療部（Rockefeller Foundation’s International Health Division）醫(yī)生Dr. Robert Briggs Watson冒著生命危險(xiǎn)，帶著一箱20個(gè)北京胡正祥教授贈(zèng)與的、用來(lái)繼續(xù)研究在亞洲肆虐的瘧疾的中國(guó)地倉(cāng)鼠，躲過(guò)交戰(zhàn)區(qū)，驅(qū)車到上海機(jī)場(chǎng)。盡管寒冷的雨滴強(qiáng)烈拍打著玻璃，泥石流隨時(shí)可以阻斷道路，zui終Watson還是成功地登上了Pan Am航班離開(kāi)了中國(guó)，將這批中國(guó)地倉(cāng)鼠運(yùn)給紐約的試驗(yàn)動(dòng)物專家Victor Schwentker。誰(shuí)也沒(méi)有想到，很多年后，伴隨他的20只中國(guó)地倉(cāng)鼠，會(huì)成為當(dāng)代藥物生產(chǎn)工業(yè)的關(guān)鍵“鑰匙”。 

美國(guó)科學(xué)家后來(lái)完成了中國(guó)地倉(cāng)鼠的繁育，使其成為科學(xué)研究的有力工具。University of Colorado Medical Center的Dr.Theodore T. Puck和他的下屬同事Fa-Ten Kao在1957年從波士頓癌癥研究中心的Georege Yerganian博士的實(shí)驗(yàn)室獲得了一個(gè)雌性中國(guó)地倉(cāng)鼠，并成功分離了CHO細(xì)胞株，由于該細(xì)胞快速懸浮生長(zhǎng)和高蛋白表達(dá)的特性，CHO細(xì)胞開(kāi)始在科研和企業(yè)獲得普遍的應(yīng)用。 

1984年，Genentech公司實(shí)現(xiàn)重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)并于1987年成功獲批上市，標(biāo)志著哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白藥物的一個(gè)標(biāo)志性事件。隨后，許多外源蛋白基因相繼被轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，一些有價(jià)值的蛋白不斷實(shí)現(xiàn)表達(dá)，包括凝血因子、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、免疫球蛋白、尿激酶、乙肝表面抗原（HBsAg）和單克隆抗體等，極大地促進(jìn)了生物藥工業(yè)的發(fā)展。同時(shí)，隨著CHO細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室的普及，科學(xué)家成功分離出的不同亞型的CHO細(xì)胞株，比如CHO-S, , CHO DXB11, CHO DG44， CHO-M以及近年來(lái)受到持續(xù)關(guān)注的GS基因敲除的CHO細(xì)胞（如Merck/Sigma Aldrich公司的CHOZN, Lonza的CHO GS Xceed, Horizon公司用rAAV技術(shù)敲除的CHO細(xì)胞）。

不過(guò)遺憾的是，由于當(dāng)時(shí)特殊的歷史背景，Robert Watson后來(lái)被中國(guó)細(xì)菌戰(zhàn)委員會(huì)指控為戰(zhàn)爭(zhēng)罪犯，這也間接導(dǎo)致了協(xié)和醫(yī)學(xué)院胡正祥教授的入獄，胡教授后來(lái)被作為“反動(dòng)學(xué)術(shù)”遭批斗po hai，1966年，胡正祥夫婦先后在家中zi sha。如今在和平年代，撫今追昔，我們緬懷為人類健康事業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)的老一輩科學(xué)家們，也更加珍惜來(lái)之不易的一切。

另一方面，伴隨著CHO細(xì)胞應(yīng)用的普及，CHO細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)業(yè)也得到了充分的研究和快速的發(fā)展。傳統(tǒng)上CHO細(xì)胞的培養(yǎng)是在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5-10%的胎牛血清完成的，血清除了供給細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)成分外，還提供了題為培養(yǎng)細(xì)胞增殖所必須的生長(zhǎng)因子，但血清的使用存在批次間差異大，易被支原體和病毒等污染，成本高，不利用產(chǎn)品分離純化等很多弊端，以及影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及zui終產(chǎn)物的質(zhì)量，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。所以從70年開(kāi)始科學(xué)家就開(kāi)始研究和開(kāi)發(fā)工業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)大大提高了CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝的便利性，可重復(fù)性以及降低了產(chǎn)品純化壓力。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基經(jīng)歷了動(dòng)物蛋白水解物培養(yǎng)基，植物蛋白水解物培養(yǎng)基到無(wú)血清化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基等幾個(gè)階段。典型的無(wú)血清培養(yǎng)基含有50-70中成分，包括氨基酸，維生素，微量元素，生長(zhǎng)因子，無(wú)機(jī)鹽，緩沖體系等。向培養(yǎng)基中添加動(dòng)物或植物的蛋白水解物可以有效地提高細(xì)胞生長(zhǎng)密度，延長(zhǎng)細(xì)胞活性，從而提高抗體表達(dá)量，常見(jiàn)的有大豆、酵母和小麥蛋白水解物等，但是由于其成分的復(fù)雜性和批次間的質(zhì)量差異，添加蛋白水解物可能會(huì)造成培養(yǎng)基批次間不穩(wěn)定從而影響培養(yǎng)過(guò)程和產(chǎn)品質(zhì)量。所以，目前及未來(lái)無(wú)血清培養(yǎng)基的趨勢(shì)是采用無(wú)動(dòng)物源、化學(xué)成分確定的配方進(jìn)行生物制藥生產(chǎn)。

由于在研發(fā)實(shí)力、質(zhì)量體系、生產(chǎn)控制和品牌影響力等方面的優(yōu)勢(shì)，外企培養(yǎng)基公司占據(jù)了細(xì)胞培養(yǎng)基市場(chǎng)的絕大部分份額，目前國(guó)外的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基公司有HAKATA（Now part of Therm Fisher）, SAFC(Now part of Merck),  Hyclone(Now part of GE Healthcare), Irvine Scientific（A member of JXTG Group）,  Lonza等，支撐了上市的眾多生物藥的商業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，不同供應(yīng)商也在努力提高培養(yǎng)基研發(fā)和生產(chǎn)的技術(shù)能力，基于不同的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用，不斷更新升級(jí)換代培養(yǎng)基的配方和配置方法。比如Thermo Fisher/HAKATA通過(guò)的AGT技術(shù)，使干粉培養(yǎng)基的配置過(guò)程變得便捷、簡(jiǎn)單。Merck/SAFC去年宣布上市了*個(gè)商業(yè)化的用于灌注工藝培養(yǎng)的培養(yǎng)基，來(lái)應(yīng)對(duì)灌注培養(yǎng)工藝的挑戰(zhàn)，美國(guó)Irvine Scientific公司也新推出了用于GMP-ready 的CHO細(xì)胞灌注培養(yǎng)基及用于Fed-batch培養(yǎng)的濃縮的補(bǔ)料BalanCD CHO Feed 4，并且Feed 4干粉配置過(guò)程同樣簡(jiǎn)單，加水溶解，無(wú)需調(diào)節(jié)pH，便捷的配置方案對(duì)生物藥工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)具有很大的吸引力。

生物醫(yī)藥行業(yè)是中國(guó)戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)，國(guó)內(nèi)生物制藥行業(yè)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，目前也有一批本土公司專注于開(kāi)發(fā)無(wú)血清培養(yǎng)基和優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝，也取得了可喜的進(jìn)展。由于不同細(xì)胞株的代謝需求不*一樣，所以很難開(kāi)發(fā)出一款能夠滿足所有細(xì)胞應(yīng)用需求的“通用型”CHO細(xì)胞培養(yǎng)基，同時(shí)為了大規(guī)模生產(chǎn)階段成本和工藝和風(fēng)險(xiǎn)控制的考慮，很多公司還是會(huì)選擇在項(xiàng)目進(jìn)展到一定程度后開(kāi)發(fā)個(gè)性化定制培養(yǎng)基，未來(lái)培養(yǎng)基的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù) – 能否保證大規(guī)模培養(yǎng)基干粉的質(zhì)量和批次穩(wěn)定性，也將成為培養(yǎng)基公司的核心競(jìng)爭(zhēng)力之一。 

總之，CHO細(xì)胞的出現(xiàn)給整個(gè)生物制藥產(chǎn)業(yè)注入了無(wú)窮的活力，產(chǎn)生了巨大的科研和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并將一直造福人類，同時(shí)，使用CHO細(xì)胞平臺(tái)表達(dá)生物藥還面臨這一些挑戰(zhàn)，需要學(xué)術(shù)和工業(yè)界一起努力，從綜合利用科學(xué)和工程的知識(shí)來(lái)解決，比如

①構(gòu)建的重組CHO細(xì)胞生產(chǎn)效率低，產(chǎn)物濃度亦低，培養(yǎng)工藝復(fù)雜，而且CHO細(xì)胞株的穩(wěn)定性還較差；

②某些糖基化表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，不易純化； 

③重組CHO細(xì)胞上游構(gòu)建與下游分離純化脫節(jié)，主要表現(xiàn)在上游構(gòu)建時(shí)著重考慮它的表達(dá)，而對(duì)高表達(dá)的產(chǎn)物的分離純化過(guò)程考慮較少； 

④重組細(xì)胞培養(yǎng)費(fèi)用昂貴，自動(dòng)化水平低下。 

隨著技術(shù)的發(fā)展和我國(guó)對(duì)生物藥產(chǎn)業(yè)投資支持力度的加大，我們也衷心希望，有朝一日我們能誕生真正屬于我們自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的“CHO細(xì)胞”及相關(guān)創(chuàng)新產(chǎn)品，更好地迎接我們生物制藥產(chǎn)業(yè)的新時(shí)代。