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閱讀:1855      發(fā)布時(shí)間:2018-3-22
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問題一:高背景
可能的原因 解決方法
去污劑不溶性蛋白有殘留 離心后立即去除上清,沉淀中留有不溶性蛋白質(zhì),如果再次有懸浮發(fā)生,再次離心
洗滌不充分 蓋上管蓋離心前反復(fù)顛倒幾次
非特異性蛋白質(zhì)與珠子結(jié)合 珠子用BSA預(yù)封閉不充分,確保牛血清白蛋白(組分V)新鮮,新鮮珠子與含1%牛血清白蛋白的PBS孵育1小時(shí),使用前PBS洗3-4次
使用的抗體特異性不強(qiáng) 使用親和純化的抗體,預(yù)先吸收
使用太多抗體導(dǎo)致非特異性結(jié)合 檢查推薦抗體用量。嘗試使用更少的抗體
細(xì)胞裂解液中含有太多的細(xì)胞或太多蛋白,導(dǎo)致洗脫液中很多額外的(假陽性)蛋白質(zhì) 減少細(xì)胞數(shù)量/裂解液使用。我們推薦使用10-500ug細(xì)胞裂解液
  蛋白與抗體非特異性結(jié)合 如果有很多非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì),可以嘗試較少上樣珠子的樣本數(shù)量。您還可以在開始免疫沉淀實(shí)驗(yàn)之前預(yù)先孵育珠子和準(zhǔn)備好的裂解液來預(yù)清除裂解液。應(yīng)該清除裂解液內(nèi)任何與珠子非特異性結(jié)合的蛋白,一些研究人員也使用同種來源和相同免疫球蛋白亞類的無關(guān)抗體來預(yù)清除裂解液
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)時(shí)抗原降解 確保樣品裂解時(shí)加入新鮮的蛋白酶抑制劑

 

問題二:大量抗體被洗脫
可能的原因 解決方法
太多抗體與目的蛋白被洗脫 嘗試減少抗體用量。免疫沉淀前將抗體與珠子交聯(lián),并使用溫和的甘氨酸緩沖液梯度洗脫將大大減少抗體洗脫量

 

問題三:沒有檢測(cè)到目的蛋白洗脫
可能的原因 解決方法
所用樣品中不表達(dá)或低水平表達(dá)目標(biāo)蛋白 檢查目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)譜,以確保他會(huì)在您樣品的細(xì)胞表達(dá)。如果有目標(biāo)蛋白低水平表達(dá),增加裂解液的使用量。但是,這可能導(dǎo)致增加非特異性結(jié)合,所以開始免疫沉淀程序之前預(yù)先清除裂解液
沒有足夠的抗體捕獲目標(biāo)蛋白 檢查抗體的建議使用量??贵w濃度可能需要增加
目標(biāo)蛋白沒有從珠子上洗脫 確保您使用的洗脫緩沖液是正確的,并且是洗脫蛋白質(zhì)所需的正確強(qiáng)度和pH值
抗體沒有結(jié)合免疫吸附磁珠 確保您使用的珠子與抗體亞型匹配
使用的裂解液不正確 檢查說明書,看看抗體是否能檢測(cè)變性蛋白質(zhì)或天然蛋白質(zhì),并確保使用正確的裂解液
 

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