| 問(wèn)題一:陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 試劑/樣品污染 | 試劑和樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑，小心操作移液器 |
| 夾心ELISA-檢測(cè)抗體與包被抗體反應(yīng) | 確定使用的是正確的包被抗體和檢測(cè)抗體，他們之間不會(huì)相互反應(yīng) |
| 酶標(biāo)板洗板不* | 用洗液充滿板空確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈 |
| 抗體量過(guò)多導(dǎo)致非特異性結(jié)合 | 根據(jù)推薦用量使用抗體盡量使用較少的抗體 |
| 問(wèn)題二：酶標(biāo)板整體背景高 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 結(jié)合反應(yīng)太強(qiáng)或時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | 檢查底物的稀釋，使用建議的稀釋度。當(dāng)酶標(biāo)儀顯色足夠進(jìn)行吸光度讀取是立即用終止液終止反應(yīng) |
| 底物溶液或終止液不是新鮮配制的 | 使用新鮮配制的底物溶液。終止液應(yīng)該是清亮的（如果它變黃，這是被污染的標(biāo)志，需要重新配制） |
| 沒(méi)有終止反應(yīng) | 如果底物反應(yīng)沒(méi)有被終止，顏色會(huì)繼續(xù)變化 |
| 酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀度板前放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | 顏色會(huì)繼續(xù)變化（盡管加了終止液，依然會(huì)以很慢的速度變化） |
| 實(shí)驗(yàn)器皿污染 | 確保試劑是新鮮配制的并且使用的是清潔的玻璃器皿 |
| 底物孵育過(guò)程沒(méi)有曝光 | 底物孵育應(yīng)該在避光條件下進(jìn)行 |
| 孵育溫度過(guò)高 | 抗體在適宜的溫度下有*的結(jié)合活性。確保孵育在正確的溫度下進(jìn)行，孵育箱要設(shè)定好溫度并正常工作，孵育溫度可能需要一些優(yōu)化 |
| 抗體非特異性結(jié)合 | 確保進(jìn)行了封閉并使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液。我們建議使用5-10%的與二抗同種動(dòng)物來(lái)源的血清或牛血清。確保孔板進(jìn)過(guò)預(yù)處理以防止非特異性結(jié)合。使用親和力強(qiáng)、純度高的抗體，經(jīng)過(guò)了預(yù)吸收 |
| 問(wèn)題三：吸光度數(shù)值低 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 使用的樣品中沒(méi)有顯示靶蛋白或者靶蛋白顯示的水平低 | 檢查靶蛋白表達(dá)系統(tǒng)，確保它在您的樣品中被表達(dá)出來(lái)。如果靶蛋白的表達(dá)水平低，需要增加樣品使用量，或者您可能需要選擇一個(gè)更加靈敏的檢測(cè)方法。確保您使用的是沒(méi)有超過(guò)測(cè)定方法檢測(cè)范圍的陽(yáng)性對(duì)照 |
| 抗體不足 | 確定使用的是建議的抗體量，為了使結(jié)果更好可能需要增加抗體的濃度 |
| 底物溶液不是新鮮配制或成分有誤 | 使用新鮮配制底物溶液。確保儲(chǔ)備液在有效期內(nèi)并且正確保存，使用的濃度也是正確的，確保試劑按正確的濃度使用 |
| 試劑不是新鮮配制或pH值有誤 | 確保試劑配制正確并在有效期內(nèi) |
| 孵育時(shí)間不夠長(zhǎng) | 如果建議了孵育時(shí)間，確保按推薦的時(shí)間長(zhǎng)度孵育抗體。為了使結(jié)果更理想，孵育時(shí)間可能需要增加 |
| 孵育溫度太低 | 抗體在適宜的溫度下有*的結(jié)合活性，確保孵育時(shí)在正確的溫度下進(jìn)行，孵育箱要設(shè)定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優(yōu)化。確保所有的試劑在使用前是室溫 |
| 未加終止液 | 加入終止液可以增加顯色反應(yīng)的強(qiáng)度，也能固定反應(yīng)zui終的顏色 |
| 問(wèn)題四：吸光值高 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 樣品和/或陽(yáng)性對(duì)照吸光度數(shù)高。吸光度沒(méi)有按樣品在板上的稀釋梯度遞減 | 樣品或陽(yáng)性對(duì)照的濃度過(guò)高，超出了實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)的范圍。重新設(shè)置實(shí)驗(yàn)方法或者在加樣前稀釋降低樣品和對(duì)照的濃度，在處理結(jié)果計(jì)算濃度時(shí)考慮到所作的稀釋 |
| 問(wèn)題五：酶標(biāo)板上吸光度不規(guī)律 | |
| 可能的原因 | 解決的方法 |
| 孵育時(shí)酶標(biāo)板疊在一起 | 酶標(biāo)板疊在一起使板子每個(gè)孔的溫度不能平衡一致，請(qǐng)避免堆積 |
| 吸液不一致 | 確保移液器使用正確并進(jìn)過(guò)校準(zhǔn)、確保槍頭差的足夠緊密。板子稀釋時(shí)要特別仔細(xì)，注意確保每個(gè)槍頭都吸上和排除正確量的液體，這對(duì)平行樣品結(jié)果的一致性有很大影響 |
| 抗體稀釋液/試劑 | 為保證板子所有孔的濃度一致，確保所有的試劑和樣品在加到板子上以前都被均勻混合 |
| 孔板變干涸 | 確保所有孵育期間酶標(biāo)板始終被蓋好。放置一個(gè)潮濕的水盤(pán)（確保清潔，無(wú)菌水）在孵育箱底部 |
| 洗板不充分 | 這將導(dǎo)致一些孔沒(méi)有其他孔清潔的好，殘留不同量的未結(jié)合的抗體，使后面的結(jié)果產(chǎn)生不一致 |
| 酶標(biāo)板底部不凈影響吸光度讀取 | 讀板前小心清潔酶標(biāo)板底部 |
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