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實(shí)驗(yàn)室WB常見問題指南之Marker,染色及內(nèi)參等相關(guān)問題

閱讀:17244      發(fā)布時(shí)間:2018-4-24
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Marker,染色及內(nèi)參等相關(guān)問題

Q:用的是預(yù)染marker,但是電泳總跑不全8條帶,請(qǐng)問什么原因?怎樣改善?膠用過8%,10%,12%,都是這樣。marker是新買的。

A:一般來說,是小分子量Marker跑走了,可以增加膠濃度或減少電泳時(shí)間。梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。(梯度凝膠愛必信就可提供呦)

Q:Western Blot哪種染色好?

A:(1)陰離子染料是zui常用的,特別是氨基黑,脫色快,背景低檢測(cè)極限可達(dá)到1.5μg,考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度,但脫色慢,背景高。麗春紅S 和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去 ,以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是:溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用于正電荷的膜。靈敏度低。

   (2)膠體金,靈敏度高,檢測(cè)范圍可到pg級(jí),但染色比穩(wěn)定。

   (3)生物素化靈敏度位于1、2之間,可用于任何一種膜。

Q:是否Western Blot實(shí)驗(yàn)半定量一定要加ACTIN內(nèi)參?

A:對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)一定要加內(nèi)參,實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。

Q用BANDSCAN分析結(jié)果行嗎?

A:分析一般的結(jié)果沒問題。

Q: 核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適?

A:可以選用組蛋白,組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的,有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參,在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。

Q轉(zhuǎn)膜時(shí)采用電流是否比電壓準(zhǔn)確,是否根據(jù)0.8mA/cm2,一般1小時(shí)左右?

A:不是的, 半干法推薦用恒流,一般根據(jù)目的蛋白的大小來確定電流和時(shí)間,一般蛋白越大,轉(zhuǎn)膜所需時(shí)間就越長(zhǎng)。

Q:封閉,一抗,二抗時(shí)的溫度有沒有什么規(guī)定呢,比如現(xiàn)在我就在室溫里做,或者要在4度下?

A:均可在室溫進(jìn)行,如果時(shí)間不夠,一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí),然后4度過夜。

Q: PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么?

A:一般而言,硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián),這樣的話,反復(fù)洗幾次后,蛋白容易掉下來,結(jié)果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合 (注:常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜),同時(shí)也有疏水作用,但相對(duì)較弱。這樣的話,PVDF膜和蛋白接合較牢,不易脫落,結(jié)果較好。

Q:酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等?

A:NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,一般建議添加。


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