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組化筆的實驗原理與意義

閱讀:8148      發(fā)布時間:2018-9-20
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    組化筆又稱免疫細(xì)胞化學(xué),是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng),對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、 組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來,借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、 電子顯微鏡)的顯像和放大作用,在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原 物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。
    自制組化筆在免疫組化染色中的應(yīng)用戴曉淳,組化筆在免疫組化染色中,為防止抗體外溢和被稀釋,必須擦掉切片組織周邊的液體,耗時費力。采用S—P法免疫組化染色的切片經(jīng)二甲苯脫蠟、純酒精脫苯后,用自制組化筆在切片組織周圍畫一圓圈,再逐級水化,以后染色步驟按試劑盒說明進(jìn)行。目前,國外生產(chǎn)的組化筆,價格貴,國內(nèi)尚未生產(chǎn)。用自制的組化筆經(jīng)標(biāo)記后,每步只需甩掉液體后直接滴加抗體進(jìn)行染色,此時滴加的抗體被限定在組化筆所劃好的范圍內(nèi),無外流現(xiàn)象。本法每張切片平均滴加抗體20~30ml,明顯節(jié)省了抗體,染色結(jié)果與擦片法比較也無明顯差別,此油性圈在組化染色完成后,經(jīng)酒精逐級脫水、二甲苯透明后即可去除。將液體灌入廢棄的MARKER筆或水彩筆,即成組化筆。
    細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶,用封閉通透液浸潤切片30min(RT 避光)配法是用預(yù)熱 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100 加熱幾分鐘后,臨用前加 400 ul 30%H 2 O 2 。PBS 溶液洗 3 次×3 min??乖迯?fù)暴露抗原決定族 10) 切片放入 0.01 M 檸檬酸鈉緩沖溶液(pH6.0)后,在微波爐里高火4min至沸騰后,再加熱約 6 min×4 次, 每次間隔補足液體, 防止干片。封閉非特異性蛋白 11) PBS 溶液洗 3 次×3 min; 12) 將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈, 在圓圈內(nèi)組織滴入 5%羊血清(與二抗來源一致)后放入濕盒中,室溫30(10~30)min。一抗孵育 13) 甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清,直接加入 已稀釋的一抗(1:250、500、1000)后,放入濕盒中室溫 1 小時,然后4度過夜,從冰箱中取出需 37 ℃復(fù)溫 45 min。二抗孵育。將一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次。用濾紙將圓圈周圍的水吸去,加入已稀釋的二抗后放入37 ℃恒溫烤箱中30min(回收)。

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