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如果想簡(jiǎn)單、快速地分離細(xì)胞，大家反應(yīng)肯定是密度梯度離心介質(zhì)；如果您想分離人淋巴細(xì)胞，那當(dāng)然少不了Ficoll啦。

Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2g／ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過(guò)生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。

PBMC（Peripheral blood mononuclear cell），外周血單個(gè)核細(xì)胞，其細(xì)胞類型為血液中具有單個(gè)核的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等，其中淋巴細(xì)胞占很大一部分。

愛(ài)必信淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)Lymphocyte Separation Medium（human, Ficoll-Paque）是一種無(wú)菌的、即用型的Ficoll-泛影酸鈉密度梯度介質(zhì)，能夠簡(jiǎn)單快速的從少量或大量的人外周血、骨髓和臍帶血中高產(chǎn)和高純度的提純淋巴細(xì)胞。本品內(nèi)毒素水平非常低，小于0.12EU/mL，分離所得的細(xì)胞中95%左右為單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞存活率大于90%，回收率為60%左右。

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Ficoll-Paque分離人外周血PBMC的示意圖：

操作protocol：

01\ 樣本準(zhǔn)備

將2mL外周血轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

用等量的2mLPBS稀釋外周血，注意吹打或顛倒混勻（如需無(wú)菌操作請(qǐng)?jiān)诔瑑襞_(tái)內(nèi)完成）；

02\ 分離步驟

在離心管中加入3mL 提前混勻的Ficoll-Paque（無(wú)菌操作請(qǐng)用注射器）；

將稀釋好的血液樣本緩慢加在Ficoll細(xì)胞分離液上，保證Ficoll與樣本之間界面清晰（注意不要吹打或顛倒混勻）；

離心300g，20℃，20min（注意要設(shè)置緩降，不能驟停）；

輕輕移除上層分離液（血漿）；

                                                       愛(ài)必信abs930 Ficoll-Paque分離淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)圖

03\ 洗滌淋巴細(xì)胞

吸取“白膜層”PBMC，將其轉(zhuǎn)移到新的15mL離心管中；

加3-5倍PBS充分混勻；

離心300g，20℃，10min（*棄去上清，沉淀即PBMC細(xì)胞）；

用適量PBS重懸、進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（當(dāng)細(xì)胞量＞10E7時(shí)，要擴(kuò)大相應(yīng)試劑用量）；

離心300g，10min（*棄去上清）；

備注：

（1）實(shí)驗(yàn)操作前，先將Ficoll-Paque和血液樣本在室溫放置一段時(shí)間，保持溫度為18℃和20℃；

（2）分離PBMC步離心的時(shí)候，一定不能設(shè)置制動(dòng)或設(shè)置低水平的制動(dòng)，否則將分層混亂。

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