欧美……一区二区三区,欧美日韩亚洲另类视频,亚洲国产欧美日韩中字,日本一区二区三区dvd视频在线

一、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP），是以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究（蛋白質(zhì)相互作用）的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整（細(xì)胞內(nèi)生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。區(qū)別于IP實(shí)驗(yàn)， CO-IP與IP只取決于檢測(cè)焦點(diǎn)是初級(jí)靶分子（抗原）還是次級(jí)靶分子（相互作用蛋白）

二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1、提取蛋白。

2、在細(xì)胞裂解液中加入抗X的抗體。

3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介質(zhì)上)。

若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成復(fù)合物：“Y—X—抗X抗體—Protein A或G"

4、經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開(kāi)。（xy抗原、x抗體）。

5、western blot分析，質(zhì)譜分析。

三、CO-IP特征

優(yōu)點(diǎn)：

1、相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)。

2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響。

3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。

局限性：

1、可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用

2、兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，有第三者在中間起橋梁作用；

3、必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇檢測(cè)的抗體，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果

四、實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵

1、實(shí)驗(yàn)需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。

2、為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3、考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。

4、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。

五、注意的問(wèn)題：

1、裂解液

(1)、細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。

(2)、不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，

2、免疫沉淀中抗體的選擇

3、抗體

使用對(duì)照抗體：（陰性和陽(yáng)性）

陰性：?jiǎn)慰寺】贵w：同一種屬的IgG

兔多克隆抗體：正常兔IgG

陽(yáng)性：細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的抗體（做膜蛋白A，用膜蛋白B）

六、未檢測(cè)到目得蛋白或蛋白很少

可能原因

1、樣品被蛋白酶降解：

添加蛋白酶抑制劑；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融

2、抗體濃度太低：

調(diào)整抗體濃度，必要時(shí)設(shè)立濃度梯度，摸索比較適合濃度

3、抗抗體親合力太低：

選用適合于IP和/或IB的相應(yīng)抗體

4、IP抗體未與珠子結(jié)合：

選用適合于IP的相應(yīng)珠子，正確保存防止變質(zhì)或干燥

5、Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表面：

改變tag融合表達(dá)部位

6、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高：

改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液

七、目得蛋白高背景

可能原因

1、非特異蛋白結(jié)合：

（1）在無(wú)血清培養(yǎng)液中裂解細(xì)胞；

（2）在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預(yù)洗，

（3）免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度（高鹽或去垢劑）

2、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低：

改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液。

3、實(shí)驗(yàn)儀器或液體被污染：

使用潔凈的儀器或液體。

4、轉(zhuǎn)移膜上的非特異吸附：

abs955免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒
 

愛(ài)必信生物爆款熱賣(mài)的abs955免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒，選用優(yōu)質(zhì)Protein A/G 瓊脂糖珠，，驗(yàn)證良好的protocol，配套輔助試劑，一站式助力您的IP/CoIP實(shí)驗(yàn)！
 

相關(guān)產(chǎn)品如下：
 

Absin特色產(chǎn)品線（全部現(xiàn)貨）：WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...