隨著現(xiàn)代醫(yī)藥生命科學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)也成為生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域（如生物制藥，疫苗研發(fā)，細(xì)胞治療及診斷領(lǐng)域）*的工具。不像其它常用的實(shí)驗(yàn)方法，細(xì)胞培養(yǎng)是一個動態(tài)的連續(xù)過程，一直有著支原體污染的困惑，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染率約為35%以上，它們競爭營養(yǎng)并釋放有毒的代謝產(chǎn)物，嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。
你是否遇到過培養(yǎng)的細(xì)胞悄無聲息的被毀掉了？
是否遇到過辛苦很久得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能重復(fù)？
選擇快速簡單高效的方式定期進(jìn)行支原體的檢測、消除和預(yù)防非常關(guān)鍵。
1.支原體到底是什么呢？
支原體是一種直徑大小僅為0.1-0.3μm，無細(xì)胞壁，可輕松透過一般過濾膜混入培養(yǎng)系統(tǒng)中的最小且簡單的原核生物，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀，分枝狀等多種態(tài)。它不同于細(xì)菌，也不同于病毒，種類繁多，分布廣泛。
實(shí)驗(yàn)室常見的種類有：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、唾液支原體、肺支原體和梨支原體等。
典型的支原體污染來源：
①細(xì)胞之間交叉污染；
②工作環(huán)境或?qū)嶒?yàn)器材的污染；
③實(shí)驗(yàn)者無菌操作不佳；
④培養(yǎng)基或其他試劑污染；
⑤制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染；
2.支原體特性是什么呢？
細(xì)胞被支原體污染后會引起：
細(xì)胞生長特征的改變，細(xì)胞代謝的抑制；
核酸合成的破壞，染色體畸變；
細(xì)胞膜抗原性的改變，并可能改變轉(zhuǎn)染率和病毒敏感性。
但是細(xì)胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。
因此支原體的定期檢測、及早發(fā)現(xiàn)及清除對細(xì)胞培養(yǎng)尤其是非常重要的細(xì)胞極為重要。
3.支原體檢測方法
細(xì)胞培養(yǎng)中有幾種不同的技術(shù)可以識別是否被支原體污染，分別是分離培養(yǎng)法，DNA熒光染色檢測法，ELISA檢測法，PCR檢測法和支原體特異酶檢測法。為給大家提供一個選擇參考，小優(yōu)這就詳細(xì)介紹下這幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。
分離培養(yǎng)法
操作方法：
從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會在這種瓊脂平板上快速生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。
分離培養(yǎng)法是支原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法，基本不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，其檢測精確度最高，具有高度的特異性和敏感性，可檢測絕大多數(shù)支原體種類。但支原體雖能在人工培養(yǎng)基上生長，但對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求較高，培養(yǎng)基較為復(fù)雜。而且檢測時間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間，若檢測到有支原體，細(xì)胞的污染范圍也已經(jīng)擴(kuò)大了，現(xiàn)在用此方法檢測的比較少。
DNA熒光染色檢測法
操作方法：
1、細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：
（1）對于貼壁細(xì)胞，在六孔板或其它多孔板內(nèi)或蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞至 50%-80%。細(xì)胞培養(yǎng)過滿會導(dǎo)致很難判斷是否存在支原體污染。
（2）對于懸浮細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞，取少量細(xì)胞做細(xì)胞涂片，空氣中充分晾干。
2、用 PBS 按照 1:10 稀釋 Hoechst 染色液(1 體積 Hoechst 染色液加入 9 體積 PBS)。稀釋后的 Hoechst 染色液宜在 24h 內(nèi)使用。
3、加適量固定液固定 10~20min。 對于六孔板的一個孔，加入 1mL 固定液。確保固定液充分覆蓋樣品，固定前切勿對細(xì)胞進(jìn) 行洗滌。對于貼壁細(xì)胞，固定前需去除培養(yǎng)液。
4、去除固定液，空氣中晾干。
5、加適量 10 倍稀釋的 Hoechst 染色液室溫染色 10~30min。 對于六孔板的一個孔，加入 1mL 染色液。確保染色液充分覆蓋樣品，染色時注意避光?？梢杂娩X箔紙避光。
6、去除染色液，空氣中晾干。
7、滴加試劑盒中提供的抗熒光淬滅封片液，封片后熒光顯微鏡下觀察藍(lán)色熒光。 熒光顯微鏡觀察時需 400 倍或 1000 倍放大觀察(需使用油鏡)。 沒有支原體污染或其它原核生物污染的細(xì)胞樣品，僅觀察到細(xì)胞核的藍(lán)色熒光，線粒體 DNA 不會被染色。
有支原體污染的細(xì)胞樣品可觀察到細(xì)胞核周圍微粒狀或絲狀藍(lán)色熒光。 支原體污染嚴(yán)重的細(xì)胞可以觀察到大量微粒狀或絲狀藍(lán)色熒光。
培養(yǎng)細(xì)胞中的細(xì)菌污染、酵母污染或霉菌污染都在光學(xué)顯微鏡下可見，但支原體污染在光學(xué)顯微鏡下不可見，通過Hoechst染色來檢測支原體，可快速、有效、高靈敏度地檢測支原體污染。但是Hoechst 染色試劑對人體有害，要注意防護(hù)；且固定液含有冰乙酸，有刺激性氣味，需要在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行固定操作；熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測。
相關(guān)產(chǎn)品
| 貨號 | 名稱 |
| abs9252-100T | 支原體染色檢測試劑盒 |
ELISA檢測法
以ELISA法為基礎(chǔ)的支原體檢測一般使用針對支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，也有一些商品化的支原體elisa試劑盒來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。不過這種方法相對復(fù)雜市面上用的也比較少。
相關(guān)產(chǎn)品
| 貨號 | 名稱 |
| abs150039-100ul | 支原體鼠單抗 |
| abs150125-100ul | 支原體鼠單抗鼠單抗,HRP標(biāo)記 |
PCR檢測法
PCR法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，可擴(kuò)增樣品中DNA的特定序列，其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。
PCR檢測法是一種靈敏而快速的方法，可以在4.5 h–1天內(nèi)識別細(xì)胞培養(yǎng)物中的支原體污染，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室也廣泛使用。但是，存在在測試過程中將污染物從陽性對照（或以前對支原體測試呈陽性的任何樣品）傳播到未受影響的樣品的風(fēng)險，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果，許多商品化的試劑盒也無法檢測所有種類的支原體。另外PCR的擴(kuò)增會被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制，需要用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取后再進(jìn)行鑒定。
支原體特異酶檢測法
操作方法：
1、取2mL培養(yǎng)基上清（建議培養(yǎng)48小時以上），200g離心5分鐘，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片；
2、取100μL上清，加入100μL裂解試劑（MycoAlert PLUS Reagent，含裂解試劑、熒光素酶、熒光素），裂解支原體；
3、室溫22℃（不超過25℃）孵育5分鐘，檢測背景ATP，測量發(fā)光值得到讀數(shù)A（Reading A）；
4、加入100μL支原體酶特異性底物（MycoAlert PLUS Substrate）；
5、室溫孵育10分鐘，測量發(fā)光值得到讀數(shù)B（Reading B），計(jì)算B/A比值。
若B/A比值小于0.9則為支原體陰性，若B/A比值大于1.2則為支原體陽性，若介于兩者之間則為結(jié)果可疑，需要繼續(xù)培養(yǎng)24h后復(fù)檢。
支原體特異酶檢測法主要是Lonza品牌的MycoAlert™方法，首先溶解支原體細(xì)胞，釋放其酶。這些酶與試劑盒中的底物發(fā)生反應(yīng)，催化ADP向ATP的轉(zhuǎn)化。螢光素酶使用此ATP來創(chuàng)建光信號，然后可以使用發(fā)光計(jì)對其進(jìn)行檢測，通過檢測底物加入前后讀數(shù)的比值，可判斷樣本中是否含有支原體。
該法為化學(xué)發(fā)光，操作簡單，無需提取DNA，快速檢測，20分鐘內(nèi)出結(jié)果，具有較高的靈敏度、特異性及相對較高的準(zhǔn)確性，已驗(yàn)證可檢測至少44種支原體，包含細(xì)胞培養(yǎng)中常見的6種支原體（口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體，占支原體污染的95%），既可以檢測新鮮樣本也可以檢測凍存樣本，可以視為常規(guī)微生物培養(yǎng)和DNA熒光染色法的替代方法。
測定方法必然是高靈敏、高特異性且快速的。但目前沒有一種非常好的檢測方法可以單槍匹馬把實(shí)驗(yàn)室污染細(xì)胞的八種主要支原體都檢測出來。大家可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)的產(chǎn)品，也可以結(jié)合使用兩種方法對支原體進(jìn)行鑒定以獲得可靠的檢測結(jié)果。
4.支原體清除
當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中存在支原體污染后，如果是不太重要或者有備份的細(xì)胞，可將培養(yǎng)物與用過的培養(yǎng)基滅活后丟棄即可。但對于珍貴的細(xì)胞就要選擇支原體清除試劑來處理細(xì)胞，并結(jié)合抗生素以*清除支原體來拯救比較重要的細(xì)胞樣品。
這里推薦Lonza的MycoZap廣譜支原體清除試劑，使用簡單，只需將支原體清除試劑加入培養(yǎng)基中，細(xì)胞毒性小，不影響細(xì)胞正常生理狀態(tài)，可在4天內(nèi)去除大范圍支原體、無膽甾原體、植物花螺原體等柔膜菌綱物種；隨后的4-6周內(nèi)，可以再用Lonza MycoAlert支原體檢測試劑盒進(jìn)行不間斷檢測，以確保后續(xù)培養(yǎng)物不被污染。
相關(guān)產(chǎn)品
| 貨號 | 名稱 |
| abs9375 | 支原體清除劑，可替代雙抗，7天左右清除 |
5.支原體預(yù)防
支原體非常頑強(qiáng)，盡管有可清除的試劑，對支原體污染的預(yù)防工作也是非常有必要的。主要可從以下幾個方面：
首先規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)始終是預(yù)防支原體感染的最佳方式，如細(xì)胞培養(yǎng)工作中多注意控制環(huán)境污染、嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作、細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌以及在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素等；
其次搭配使用預(yù)防試劑，如Lonza MycoZap支原體預(yù)防試劑特異性預(yù)防支原體污染的抗生素，其中MycoZap Plus可預(yù)防包括支原體、革蘭氏陽xing菌、革蘭氏陰性菌、真菌、酵母在內(nèi)的多種微生物污染，其配方也根據(jù)細(xì)胞系、原代細(xì)胞進(jìn)行了特殊優(yōu)化。
最后定期檢測也很重要，支原體感染會使培養(yǎng)細(xì)胞慢慢枯萎，將定期支原體檢測常規(guī)化堅(jiān)持下去，也是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對支原體感染的關(guān)鍵。
建議檢測頻率
| 新細(xì)胞進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室 | 必檢 |
| 液氮保存前 | 必檢 |
| 定期常規(guī) | 每月檢測一次 |
| 發(fā)現(xiàn)污染后 | 每周檢測一次 |
| 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異常 | 隨時檢測 |
相關(guān)產(chǎn)品
| 貨號 | 名稱 |
| abs9376 | 支原體預(yù)防劑 |
談到支原體污染，小優(yōu)還特別邀請到了Lonza資深應(yīng)用技術(shù)專家做一場線上講座：
主題：支原體對細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的危害及快速檢測方法介紹
時間： 2021.6.7 周一16:00-17:00
地點(diǎn)：小優(yōu)博士（小程序）
方式：直播+回放，可預(yù)約提醒
講座主要內(nèi)容
什么是支原體污染，支原體污染對實(shí)驗(yàn)影響的統(tǒng)計(jì)情況
MycoAlert快速支原體檢測方法介紹
搭配Lucetta2.0的支原體檢測實(shí)驗(yàn)流程
除了支原體污染相關(guān)的講座，近期小優(yōu)攜手Lonza品牌開展了一系列的線上講座，敬請關(guān)注。
更多支原體檢測，清除及預(yù)防相關(guān)問題可聯(lián)系優(yōu)寧維。
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| abs972 | 胎牛血清(優(yōu)級) |
| abs973 | 胎牛血清(優(yōu)級),輻照 |
| abs974 | 胎牛血清(標(biāo)準(zhǔn)級) |
| abs975 | 胎牛血清(標(biāo)準(zhǔn)級),輻照 |
Absin特色產(chǎn)品線(全部現(xiàn)貨)： |
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