欧美……一区二区三区,欧美日韩亚洲另类视频,亚洲国产欧美日韩中字,日本一区二区三区dvd视频在线

2023年2月8日，俄亥俄州立大學(xué)董一州團(tuán)隊(duì)在Advanced Science發(fā)表了一篇LNP成功遞送saRNA至精母細(xì)胞治療小鼠不育的文章“Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice"。

基因突變引起的男性不育癥是不育癥的重要類型。目前，臨床上還沒(méi)有可靠的方法來(lái)解決這種醫(yī)療需求。

mRNA療法的出現(xiàn)為修復(fù)生殖系統(tǒng)中的突變基因提供了一種可能的策略。然而，將mRNA有效遞送至精母細(xì)胞仍然是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。因此，研究團(tuán)隊(duì)希望開發(fā)一種新的LNP可以將saRNA有效遞送至精母細(xì)胞，用于治療男性不育癥。

一、CAP LNP的合成、配方和表征

為了增強(qiáng)mRNA遞送進(jìn)入精子細(xì)胞，在生物膜和男性生殖系統(tǒng)起到關(guān)鍵作用的一些生物活性分子引起研究人員的關(guān)注。例如，膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，維持細(xì)胞膜的完整性和通透性。先前有研究報(bào)道在精子生成過(guò)程中膽固醇水平會(huì)升高，這表明膽固醇代謝與生育能力之間存在密切關(guān)系。此外，磷酸基團(tuán)是磷脂的極性部分，同時(shí)也是是生物膜的關(guān)鍵組成部分，參與細(xì)胞運(yùn)輸途徑。最后，氨基可以電離變?yōu)檎娦缘模c帶負(fù)電的mRNA相互作用。除了生物活性之外，可電離的脂質(zhì)的幾何結(jié)構(gòu)，可以用包封參數(shù)（P值）來(lái)描述，會(huì)極大地影響 LNPs的傳遞效率。通常，P 值大的脂質(zhì)有利于形成倒錐形，有利于內(nèi)體膜的倒六邊形（HII 相）轉(zhuǎn)變和遞送貨物的內(nèi)體逃逸。

為了實(shí)現(xiàn) LNPs 將編碼功能蛋白的 mRNA 遞送進(jìn)精母細(xì)胞中，恢復(fù)精子生成的目標(biāo)，他們整合了3個(gè)生物活性分子單元，設(shè)計(jì)一系列膽固醇-氨基-磷酸酯(CAP)脂質(zhì)，配制成CAP LNPs。CAP LNP 由CAP、DOPE、DMG-PEG和編碼Dmc1的mRNA配制而成。在顯微注射到曲細(xì)精管后，CAP LNP將Dmc1 mRNA遞送到精母細(xì)胞，從而恢復(fù)染色體重組和精子發(fā)生。

圖1 使用CAP LNP遞送編碼Dmc1的 mRNA 的示意圖

首先，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一條 CAP 衍生物的合成路線（圖 2a），并進(jìn)一步表征了它們的理化性質(zhì)，最終選擇了CAP2-4 LNPs進(jìn)行后續(xù)研究。研究者應(yīng)用 CAP2-4 LNP 在Dmc1 ^-/-小鼠模型中遞送綠色熒光蛋白(GFP) mRNA，24小時(shí)后分析 GFP 的表達(dá)。如圖 2e所示，CAP2-4 LNPs 在曲細(xì)精管周圍誘導(dǎo)出明顯的綠色熒光，而 MC3 LNPs 和 ALC-0315 LNPs 組中幾乎檢測(cè)不到 GFP 信號(hào)。這些結(jié)果證明 CAP2-4 LNPs 是精母細(xì)胞中 mRNA 遞送的優(yōu)良載體，遞送效率明顯高于 MC3 和 ALC-0315 LNPs。

圖2 CAP 脂質(zhì)的合成方法、3D結(jié)構(gòu)以及在生精小管中的遞送效率比較

二、CAP LNP可將saRNA遞送至Dmc1^-/-小鼠模型中的精母細(xì)胞

接下來(lái)，作者比較了傳統(tǒng) mRNA和saRNA 之間 Dmc1 蛋白的表達(dá)時(shí)程。他們將帶有 Flag 標(biāo)簽的 Dmc1 mRNA 或 saRNA 封裝到CAP2-4 LNP 中，并將兩種制劑注射到 Dmc1^-/-小鼠的曲細(xì)精管中。給藥后24和72小時(shí)，通過(guò)免疫熒光染色評(píng)估曲細(xì)精管中 Dmc1 的表達(dá)。如圖3a所示，在CAP2-4 LNP-mRNA和CAP2-4 LNP-saRNA 處理的小鼠中24小時(shí)均觀察到明顯的 Dmc1 表達(dá)，但在未處理的小鼠中則沒(méi)有。CAP2-4 LNP-mRNA給藥72小時(shí)后，曲細(xì)精管中幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)（圖3b）。相反，CAP2-4 LNP-saRNA處理組仍然顯示出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)（圖3b）。這些結(jié)果表明，通過(guò) CAP2-4 LNP 遞送 saRNA 可以維持 Dmc1 蛋白表達(dá)至少三天。

圖3 在 Dmc1^-/-小鼠中遞送編碼 Dmc1蛋白的傳統(tǒng)mRNA或saRNA

三、使用CAP LNP遞送saRNA恢復(fù)Dmc1蛋白功能

隨后，作者通過(guò)分析聯(lián)會(huì)復(fù)合體(SC)來(lái)檢查 Dmc1 蛋白的功能。SC 是在減數(shù)分裂 I 期間形成的特定結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)同源染色體的聯(lián)會(huì)。由于 Dmc1 缺陷可破壞 SC 形成并阻止減數(shù)分裂 I 后期的精子發(fā)生，因此 SC 被認(rèn)為是 Dmc1 蛋白功能恢復(fù)的關(guān)鍵指標(biāo)。Dmc1^-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理，處理后第4天，收集睪丸。通過(guò) SYCP1 和 SYCP3（參與 SC 形成的兩個(gè)主要成分）的免疫熒光染色檢查精母細(xì)胞中的 SC。如圖4a所示, SYCP3和SYCP1染色清楚地顯示了 WT 小鼠的五個(gè)亞階段的特征模式，包括細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期。在CAP2-4 LNP-saRNA 處理組中，我們觀察到處于粗線期的SC，這表明同源染色體聯(lián)會(huì)的恢復(fù)。此外，對(duì)SC在雙線期和終變期的觀察進(jìn)一步證實(shí)了SC可以解體并轉(zhuǎn)運(yùn)到中期（圖4b）。相反，來(lái)自 Dmc1^-/-小鼠的 SC 在前期的早期階段被阻滯，并且未觀察到粗線期、雙線期和終變期的 SC（圖4c）。如圖4d所示，在 CAP2-4 LNP-saRNA 處理后，粗線期、雙線期和終變期精母細(xì)胞的百分比分別增加到 11%、6% 和 2%?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明使用 CAP LNP 遞送 saRNA 可恢復(fù)精母細(xì)胞中 Dmc1 蛋白的功能。

圖4 使用CAP LNP遞送saRNA可恢復(fù)Dmc1^-/-小鼠中的Dmc1功能

四、CAP LNP-saRNA 挽救 Dmc1^-/-小鼠的精子發(fā)生

最后，作者研究了通過(guò) CAP2-4 LNP-saRNA 恢復(fù) Dmc1 蛋白是否可以挽救 Dmc1^-/-小鼠的不育癥。Dmc1^-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理。處理后第10天，收集睪丸和附睪。睪丸和附睪切片用花生凝集素(PNA)染色，它可以特異性結(jié)合精子細(xì)胞頂體（圖5a）。PNA 染色的精子細(xì)胞位于 WT 小鼠的曲細(xì)精管和附睪管中。然而，Dmc1^-/-小鼠的睪丸和附睪中沒(méi)有細(xì)胞被 PNA-凝集素染色，表明精子細(xì)胞生產(chǎn)喪失。相比之下，我們?cè)?CAP2-4 LNP-saRNA 治療組的曲細(xì)精管和附睪管中觀察到了 PNA染色的細(xì)胞，這是挽救 Dmc1^-/- 小鼠不育表型的直接證據(jù)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，治療組每根小管的PNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于未治療組，達(dá)到WT組的二分之一左右（圖5b）。因此，這些結(jié)果證明，使用 CAP LNP 遞送 saRNA可以有效挽救 Dmc1^-/-小鼠中的精子細(xì)胞產(chǎn)生。

此外，對(duì)睪丸樣本進(jìn)行組織學(xué)分析以評(píng)估生精發(fā)育。如圖5c所示，WT 小鼠表現(xiàn)出正常的睪丸形態(tài)，而 Dmc1^-/-小鼠在精母細(xì)胞階段表現(xiàn)出精子發(fā)生停滯并且缺乏減數(shù)分裂后細(xì)胞。與 WT 小鼠相比，Dmc1^-/-小鼠的生發(fā)層厚度和生精管直徑顯著降低（圖5d，e）。相比之下，CAP2-4 LNP-saRNA 重建了 Dmc1^-/-小鼠的睪丸形態(tài)，增加了生發(fā)層厚度和生精管直徑（圖5d，e)。精子懸液細(xì)胞學(xué)涂片顯示，CAP2-4 LNP-saRNA處理組的附睪產(chǎn)生橢圓頭單尾不卷曲的精子，而未處理組未觀察到精子樣細(xì)胞（圖5f）。

圖5 使用 CAP LNP 遞送saRNA可挽救 Dmc1 ^-/-小鼠的不育表型

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究利用 CAP LNPs 可以向精母細(xì)胞傳遞 mRNA，證明基于mRNA療法在治療由基因突變引起的男性生殖疾病方面的可行性。Absin擁有成熟的mRNA制備及LNP包裹技術(shù)。

線性mRNA定制流程：

線性mRNA定制化合成/定制化服務(wù) 服務(wù)參數(shù)： 1、合成量大于等于200ug/條 2、加帽方式：化學(xué)共轉(zhuǎn)錄法 推薦帽結(jié)構(gòu)：CynCap AG 3、修飾堿基： N1-methyl-Pseudouridine-5'-Triphosphate 4、標(biāo)準(zhǔn)定制UTR：Cyn-CBT  5、序列設(shè)計(jì)：1條（定制化合成）；不少于3條（定制化服務(wù)） 6、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控：RNA完整性檢測(cè)，RNA純度膠圖 7、可選實(shí)驗(yàn)：LNP包裹（請(qǐng)?jiān)儍r(jià)） 8、合成周期：2-4周（定制化合成，不包括細(xì)胞驗(yàn)證） 4-8周（定制化服務(wù)）

環(huán)狀RNA定制流程：

環(huán)狀RNA定制化合成/定制化服務(wù) 服務(wù)參數(shù)： 1、合成量大于等于200ug/條 2、標(biāo)準(zhǔn)IRES：CYN-IRES-G 3、合成序列條數(shù)大于等于1條（定制化合成）；不低于3條（定制化服務(wù)） 4、標(biāo)準(zhǔn)交付：1.0 ug/ul 5、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控：濃度；純度 6、合成周期：4-8周（定制化合成）；6-8周（定制化服務(wù)）

標(biāo)準(zhǔn)臨床概念驗(yàn)證方案流程：

標(biāo)準(zhǔn)臨床概念驗(yàn)證方案是我司新推出的專項(xiàng)服務(wù)，可以同時(shí)匹配mRNA線性/環(huán)狀技術(shù)，協(xié)助快速推進(jìn)靶點(diǎn)的概念驗(yàn)證，推進(jìn)不同構(gòu)型的mRNA技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上獲得藥效學(xué)結(jié)果，以期能夠快速進(jìn)入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的級(jí)別。

對(duì)于mRNA定制業(yè)務(wù)及技術(shù)感興趣的客戶歡迎聯(lián)系我們進(jìn)行詳細(xì)咨詢、交流。 

[1] Du S, Li W, Zhang Y, et al. Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice. Adv Sci (Weinh). 2023 Feb 7:e2300188.

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...