動物活體成像技術(shù)主要包括生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是利用熒光素酶基因標(biāo)記DNA，通過基因表達產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號（圖1）。熒光發(fā)光采用熒光物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗體、納米材料、藥物等導(dǎo)入到活體體內(nèi)，通過外界激發(fā)光源激發(fā)獲取成像。
圖1 生物發(fā)光活體成像檢測原理
通過活體成像技術(shù)可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達和藥物作用效果等生物學(xué)過程。前期小愛介紹了兩種活體發(fā)光成像技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用案例，我們可以根據(jù)自己的實驗需求結(jié)合技術(shù)的優(yōu)缺點（表1）選擇合適的體內(nèi)發(fā)光技術(shù)。
表1 生物發(fā)光與熒光發(fā)光成像技術(shù)優(yōu)缺點
成像設(shè)備 | 優(yōu)點 | 缺點 | 應(yīng)用領(lǐng)域 |
生物發(fā)光成像 | 實時長期監(jiān)測體內(nèi)的各種生物學(xué)過程； | 成本較高； | 基因表達，細(xì)胞、病毒和細(xì)菌示蹤等。 |
熒光成像 | 簡單、方便、價廉； | 背景噪音強，靈敏度低； | 基因表達，蛋白和小分子、細(xì)胞、病毒和細(xì)菌示蹤等。 |
本期小愛以生物發(fā)光成像實驗為例帶大家一起學(xué)習(xí)動物活體成像實驗具體操作流程。
一個完整的生物發(fā)光活體成像過程包括構(gòu)建熒光素酶重組質(zhì)粒、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選、熒光素酶活性鑒定陽性克隆，再將陽性克隆細(xì)胞移植到體內(nèi)建立動物模型，進而通過小動物活體成像系統(tǒng)檢測動物體內(nèi)特定部位發(fā)出的熒光信號。最后取出腫瘤組織，通過染色進行病理形態(tài)學(xué)分析。
1、構(gòu)建熒光素酶重組質(zhì)粒
含熒光素酶的重組質(zhì)粒根據(jù)實驗需求可以自己實驗室構(gòu)建，也可以來源于其它實驗室惠贈或市售。
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選
常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法是化學(xué)轉(zhuǎn)染法，對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等），可以使用轉(zhuǎn)染增強劑聚凝胺(abs42025397)來提高轉(zhuǎn)染效率。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的操作步驟進行轉(zhuǎn)染即可。
為篩選穩(wěn)定表達目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素min濃度，可以通過建立殺滅曲線來實現(xiàn)，我們以G-418(abs44062790)最佳篩選濃度的確定為例。
1）第一天：處于對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度（對于需要更高密度來檢測活力的細(xì)胞，可增加接種量）。鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過夜；
2）根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000μg/mL；
3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度G-418的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔；
4） 接下來每3-4天更換新的含G-418的培養(yǎng)基；
5）按照固定的周期（如每2天）進行活細(xì)胞計數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的min濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。
3、熒光素酶活性鑒定陽性克隆
篩選的單一抗性克隆傳代至第五代時用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性。
1）按1×105個/孔接種到24孔板，24h后裂解細(xì)胞，12000rpm，4℃離心10min，收集裂解物；
2）取上清10μL加入96孔白板中，向每孔加入50μL熒光素酶底物，反應(yīng)片刻讀取熒光值，每個克隆設(shè)3個復(fù)孔；
3）保留熒光值高的細(xì)胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，再過5代后進行熒光素酶活性檢測。保留熒光值維持較高的克隆直至第30代，熒光素酶活性最高的幾個克隆即為陽性克隆。
需要注意的是，篩選的陽性克隆細(xì)胞數(shù)理論上應(yīng)與發(fā)光強度具有線性相關(guān)性，并且陽性克隆細(xì)胞應(yīng)和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有相似的生長趨勢。因此，我們在確定陽性克隆細(xì)胞系后可以增加這兩個驗證實驗以確保整個實驗的完整性和可靠性。
4、動物模型構(gòu)建
篩選陽性克隆細(xì)胞株后，通常需要將細(xì)胞注射到動物體內(nèi)構(gòu)建模型，通過體內(nèi)成像觀察腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是也需要根據(jù)腫瘤類型和研究目的，選擇較適合的模型。一般腫瘤細(xì)胞的注射方式包括以下幾種：
表2 常用腫瘤細(xì)胞注射方式
注射方式 | 操作 | 用途 |
皮下 | 注射部位包括側(cè)腹面、背側(cè)面及腋下。 | 為血液及皮膚腫瘤相關(guān)研究提供便利。 |
腹腔 | 腫瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔。通常會引起一定程度的腹水及浸潤性轉(zhuǎn)移。 | 適合某些腫瘤轉(zhuǎn)移過程，如卵巢癌。 |
尾靜脈 | 腫瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射，通過肺部的毛細(xì)血管網(wǎng)進入動脈血液循環(huán)系統(tǒng)，造成全身多發(fā)轉(zhuǎn)移灶。 | 常見于血液腫瘤的研究中。 |
原位 | 將腫瘤細(xì)胞直接注射至原器官，所營造的腫瘤微環(huán)境更接近于人體。 | 適用于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤如脊索瘤、腦膠質(zhì)瘤等；前列腺癌、卵巢癌等的轉(zhuǎn)移研究。 |
脾臟 | 將腫瘤細(xì)胞注射在脾臟后通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到肝臟。 | 可以更好地模擬肝轉(zhuǎn)移瘤形成。 |
左心室 | 腫瘤細(xì)胞經(jīng)過左心室注射進入小鼠體循環(huán)，經(jīng)過一系列過程，最終造成不同器官的轉(zhuǎn)移。 | 常用于研究骨、腦及乳腺癌轉(zhuǎn)移。 |
小愛以裸鼠皮下移植瘤模型的建立為例，具體實驗步驟如下：
1）BALB/c nude裸鼠，4周齡，體重（15±2）g，雌雄各3只；
2）取對數(shù)生長期的熒光素酶陽性克隆細(xì)胞，用PBS重懸為55×107/mL 懸液，每只裸鼠左右背側(cè)近腋部皮下接種100μL，共接種6只；
3）接種后第5天采用活體成像系統(tǒng)檢測信號強度。以后每5天觀察一次，連續(xù)觀察30天；
4）觀察前按150mg/kg體重的量腹腔注射底物D-熒光素(abs42017256)，10分鐘后，腹腔注射3%pentobarbital sodium溶液，進行活體成像觀察皮下腫瘤的生長情況，定量分析各時間點的熒光值，繪制腫瘤皮下生長曲線。
5、病理形態(tài)學(xué)觀察
病理形態(tài)學(xué)觀察常見的染色方式有HE、IF、IHC、mIHC等，染色原理及作用如表3，可以根據(jù)實驗需求選擇合適的方法進行染色分析。值得注意的是，隨著科學(xué)家對疾病的深入探究，越來越多的科研學(xué)者更傾向于mIHC染色技術(shù)，而且發(fā)表的文章影響因子相對較高。
動物活體成像觀察結(jié)束后，脫頸處死小鼠，取腫瘤組織，制成石蠟切片，切片厚度為3μm，按照試劑盒說明書的操作步驟經(jīng)染色后觀察組織細(xì)胞的病理形態(tài)。
表3 HE、IF、IHC、mIHC染色方法的區(qū)別
染色方法 | 染色原理 | 作用 |
HE：蘇木精—伊紅染色 | 蘇木精為堿性染液，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。 | 可顯示組織正常與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu) |
IF：免疫熒光 | 抗原與抗體特異性結(jié)合，將熒光素標(biāo)記在抗體或抗原上，然后與其對應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合。 | 檢測組織中蛋白以及特異性細(xì)胞的表達分布。 |
IHC：免疫組化 | 抗原與抗體特異性結(jié)合，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子和同位素）顯色。 | 確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對其進行定位、定性及相對定量。 |
mIHC：多重?zé)晒饷庖呓M化 | TSA酪酰胺信號放大技術(shù)&抗原與抗體特異性結(jié)合，可標(biāo)記多個靶點（4~7種顏色）。 | 對靶蛋白或核酸進行高密度原位標(biāo)記，使檢測信號幾何級放大。 |
（注：本文來源于文獻總結(jié)，僅供參考）
活體動物光學(xué)成像技術(shù)讓研究人員能夠觀察活體動物體內(nèi)的基因表達和細(xì)胞活動，是將分子及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)從體外研究發(fā)展到活體動物體內(nèi)的強有力手段，該技術(shù)推進了人們對各種生命活動、疾病過程的深入認(rèn)識，正在被越來越廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
動物成像熒光染料
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | CAS | 規(guī)格 |
abs42017256 | D-熒光素 | 2591-17-5 | 5mg |
abs42017259 | D-蟲熒光素鈉鹽 | 103404-75-7 | 100mg |
abs42075819 | D-熒光素鉀鹽 | 115144-35-9 | 100mg |
abs45153692 | DiR 碘化物 | 100068-60-8 | 100mg |
abs47047731 | Cyanine7 NHS ester | 1432019-64-1 | 1mg |
abs47047734 | Cyanine7.5 | — | 5mg |
細(xì)胞處理相關(guān)試劑
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs47014935 | 細(xì)胞消化液（干細(xì)胞級別） | 100mL |
abs47014938 | 胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) ，含酚紅 | 500mL |
abs47048001 | 膠原酶II型 | 1g |
abs9241 | 紅細(xì)胞裂解液，10X | 500mL |
abs9483 | 高糖 DMEM 培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉） | 500mL |
abs972 | 胎牛血清（優(yōu)級） | 500mL |
細(xì)胞轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格/濃度 |
abs42025397 | 聚凝胺（轉(zhuǎn)染增強劑） | 1mL |
abs44062790 | G-418溶液（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染較常用的抗性篩選試劑） | 10mL |
abs47014830 | 滅瘟素溶液（篩選攜帶bsr/BSD基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞） | 1mL |
abs60252 | 小核酸轉(zhuǎn)染試劑 | 1mL |
abs60255 | 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑盒（貼壁細(xì)胞） | 1.5mL |
abs9461 | 轉(zhuǎn)染專用減血清培養(yǎng)基 | 500mL |
組織染色相關(guān)試劑
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs42024259 | 油紅O | 100g |
abs47047618 | 姬姆薩染液 | 500mL |
abs50012 | 四色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒（鼠兔二抗） | 20T |
abs50037 | 七色多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒plus（鼠兔二抗） | 20T |
abs9217 | 蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒 | 100mL |
abs994 | 抗體洗脫液（mIHC專用） | 30mL |
腫瘤細(xì)胞抑制劑
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | CAS | 規(guī)格 |
abs810001 | LY 294002 | 154447-36-6 | 100mg |
abs810002 | SB 203580 | 152121-47-6 | 100mg |
abs810004 | Genistein | 446-72-0 | 50mg |
abs810012 | Brefeldin A | 20350-15-6 | 10mg |
abs810030 | Rapamycin | 53123-88-9 | 10mg |
abs812121 | Luminespib | 747412-49-3 | 25mg |
* 溫馨提示：absin所有產(chǎn)品僅用于科學(xué)研究，請勿藥物、家用或其他用途。
好消息！Absin文獻獎勵重磅升級！
Absin特色產(chǎn)品線：
WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
8
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務(wù)