生物制品是指以微生物、細(xì)胞、動物或人源組織和體液等為起始原材料，用生物學(xué)技術(shù)制備，用于預(yù)防、治療和診斷人類疾病的制劑。當(dāng)前，隨著越來越多的生物制品進(jìn)入治療領(lǐng)域，于是生物制品與之俱來的生物安全性問題被漸漸提上日程，生物制品的質(zhì)量控制也日趨嚴(yán)格。其中宿主細(xì)胞殘留核酸由于可能會傳遞腫瘤或病毒相關(guān)基因，存在潛在致癌性和感染性風(fēng)險。各國藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)對生物制品中宿主細(xì)胞殘留核酸的態(tài)度謹(jǐn)慎且明確，要求各制藥企業(yè)建立詳細(xì)可行、靈敏度高的檢測方法，用于驗證藥品的純化過程可以去除殘留DNA，并對終產(chǎn)品的放行嚴(yán)格把關(guān)，避免攜帶外源DNA的藥品流入市場。
宿主細(xì)胞殘留DNA標(biāo)準(zhǔn)
各國藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)均對生物制品中宿主細(xì)胞DNA的殘留量進(jìn)行了嚴(yán)格的限度控制以規(guī)避風(fēng)險。
表1 宿主細(xì)胞殘留DNA標(biāo)準(zhǔn)
藥典 | 標(biāo)準(zhǔn) |
中國藥典2020版 | 以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑DNA殘留量不能超過100pg/劑； 以細(xì)菌或真菌基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗，其宿主DNA殘留量應(yīng)≤10ng/劑。 |
WHO | 推薦非腸道接種成品中殘留DNA不高于10ng/劑； 口服類成品中殘留DNA不高于100ug/劑。 |
FDA | 生物制品宿主細(xì)胞DNA殘余限度為100pg/劑； 對于大劑量生物制品如單克隆抗體，根據(jù)其殘留DNA來源及給藥途徑不同，DNA殘留量可放寬至10ng/劑； 對于選用連續(xù)非致瘤性細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品成品，其DNA殘留量應(yīng)控制在10ng/劑以下，長度不大于200bp。 |
歐洲藥典 | 規(guī)定生物制品殘留DNA限度不超過10ng/劑。 |
除了對宿主核酸殘留量有限度規(guī)定，我國對于DNA殘留片段的大小也有了明文規(guī)定：2022年，我國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布的《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中提到對于生產(chǎn)若使用了腫瘤細(xì)胞系致瘤細(xì)胞系或攜帶有致瘤基因、病毒來源序列的細(xì)胞（如HEK 293T細(xì)胞），在確保無完整活細(xì)胞殘留的同時，需對DNA的殘留量和殘留片段大小進(jìn)行控制。建議盡量將殘留DNA控制在10ng/劑以內(nèi)，DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。
表2 宿主細(xì)胞殘留DNA片段風(fēng)險因子
宿主細(xì)胞殘留DNA片段大?。╞p） | 風(fēng)險因子 |
＜200 | 1 |
200-1000 | 2 |
＞1000 | 3 |
＞1000 | 4 |
注：片段越長，風(fēng)險因子越大。
宿主細(xì)胞殘留DNA檢測方法
為確保生物制品的安全性和質(zhì)量，因此建立合適的宿主細(xì)胞殘留DNA檢測方法至關(guān)重要?！吨袊幍?020年版》通則3407中推薦了三種外源性DNA殘留量測定方法，包括DNA探針雜交法、熒光染色法和定量PCR法。
表3 宿主細(xì)胞殘留DNA檢測方法
方法學(xué) | DNA探針雜交法 | 熒光染色法 | 定量PCR法 |
檢測原理 | 將特異性單鏈DNA探針標(biāo)記后與供試品單鏈DNA雜交，并使用與標(biāo)記物相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽性DNA對照比對后，根據(jù)顯色的深淺判斷供試品中外源性DNA殘留量。 | 應(yīng)用雙鏈DNA熒光染料與雙鏈DNA特異性結(jié)合形成復(fù)合物在波長480nm激發(fā)產(chǎn)生熒光型號，根據(jù)供試品的熒光強(qiáng)度，計算供試品中DNA的殘留量。 | PCR反應(yīng)過程中可通過熒光標(biāo)記的特異性探針或熒光染料摻入而檢測PCR產(chǎn)物量。在反應(yīng)過程中釋放的熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時,體系的PCR環(huán)數(shù)(Ct)與起始DNA板量的對數(shù)值呈線性關(guān)系。采用已知濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,對特定模板進(jìn)行定量分析,測定供試品中的外源DNA殘留量。 |
特異性 | 中 | 低 | 高 |
靈敏度 | 10fg/uL | 1pg/uL | 1fg/uL |
檢測時長 | 5-6h | 0.5-1h | 1-1.5h |
檢測范圍 | 0.01-100pg/uL | 1.25-80pg/uL | 0.01-100pg/uL |
其中定量PCR法因其檢測特異性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好、通量高、耗時短等優(yōu)點(diǎn)現(xiàn)已成為生物制品工藝研究和產(chǎn)品質(zhì)量控制的檢測方法。愛必信最終選擇更準(zhǔn)確、可靠、科學(xué)的熒光探針（TaqMan®）qPCR法作為細(xì)胞殘留DNA檢測的方法。推出了一系列宿主細(xì)胞殘留核酸定量檢測試劑盒，能夠?qū)Ｒ豢焖俚膶χ锌貥悠坊蛟撼善分兴拗骷?xì)胞殘留核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量，靈敏、準(zhǔn)確和定量下限，能滿足病毒疫苗生產(chǎn)、重組蛋白藥物純化、細(xì)胞治療和疫苗研究中緩解PBMC細(xì)胞結(jié)團(tuán)以及慢病毒的大規(guī)模純化等工業(yè)客戶的工藝研究和質(zhì)控需求。
圖 熒光探針（TaqMan®）qPCR法
宿主細(xì)胞殘留DNA檢測流程
宿主細(xì)胞殘留DNA檢測流程主要包含宿主細(xì)胞殘留DNA提?。ù胖榉ǎ┖退拗骷?xì)胞殘留DNA定量檢測（熒光探針（TaqMan®）qPCR法）。
圖 宿主細(xì)胞殘留DNA檢測流程
宿主細(xì)胞殘留核酸提取
宿主細(xì)胞殘留DNA（磁珠法）樣本前處理試劑盒（abs60544）用于生物制品樣本前處理，精準(zhǔn)抽提各種生物制品中宿主細(xì)胞殘留DNA。搭配宿主殘留DNA/DNA片段檢測試劑盒使用。
產(chǎn)品優(yōu)勢：
1）靈敏度高：靈敏度可達(dá)0.03pg/uL，回收率可達(dá)70-130%，符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)；
2）通用性強(qiáng)：可手動提取、可配合全自動核酸提取儀自動化提取，滿足高通量；
3）適用性強(qiáng)：適用于E.coli、HEK293、Vero、CHO等多種宿主DNA樣本；
4）操作便捷：消化時間僅15min，配合核酸提取儀1h內(nèi)完成整個提取過程。
產(chǎn)品信息：
樣本核酸提取 | ||
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs60544 | 宿主細(xì)胞殘留DNA（磁珠法）樣本前處理試劑盒 | 100T |
宿主細(xì)胞殘留核酸/DNA片段檢測
產(chǎn)品優(yōu)勢：
1）快速便捷：方便操作，1h出結(jié)果；
2）穩(wěn)定性高：受環(huán)境影響較小，保質(zhì)期內(nèi)性能穩(wěn)定；
3）精密度高：各濃度檢測值CV<15%；
4）專一性強(qiáng)：考察生物制品生產(chǎn)中常用的DNA對檢測試劑盒的干擾，干擾組應(yīng)與對照組重合，未見干擾。
產(chǎn)品信息：
宿主細(xì)胞殘留核酸檢測 | ||
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs60543 | 質(zhì)粒DNA殘留（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60545 | HEK293殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60546 | 293T細(xì)胞殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60547 | Human殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60548 | Hela細(xì)胞殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60549 | E1A殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60550 | E1A&SV40LTA殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60551 | E.coli殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60552 | E.coli總RNA殘留（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60553 | CHO殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60554 | Vero殘留 DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60555 | 畢赤酵母殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
abs60556 | PG13殘留DNA（qPCR）檢測試劑盒 | 100T |
宿主細(xì)胞殘留DNA片段分析 | ||
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs60557 | HEK293殘留DNA片段（qPCR）檢測試劑盒 | 100T×4 |
abs60558 | 293T細(xì)胞殘留DNA片段（qPCR）檢測試劑盒 | 100T×4 |
abs60559 | Human殘留DNA片段（qPCR）檢測試劑盒 | 100T×4 |
abs60560 | Hela細(xì)胞殘留DNA片段（qPCR）檢測試劑盒 | 100T×4 |
abs60561 | Vero 殘留 DNA 片段（qPCR）檢測試劑盒 | 100T×4 |
參考文獻(xiàn)
[1] State Administration for Market Regulation. Administrative measures for the batch release of biological products[S].2020-12-11
[2]《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，2022年5月
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WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...
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