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外泌體概述：

外泌體是由活細(xì)胞分泌的，包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)，直徑在30-150nm的具有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，現(xiàn)在特指直徑40-100nm的盤狀囊泡，主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。所有培養(yǎng)的細(xì)胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等。

圖 外泌體示意圖

外泌體構(gòu)成：

外泌體富含膽固醇和鞘磷脂，并攜帶有DNA、mRNA、microRNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及一些代謝物，目前已經(jīng)通過286項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了41860種蛋白質(zhì)、2838種microRNA、3408種mRNA。

外泌體功能：

1）介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子轉(zhuǎn)移。作為多重信號(hào)顆粒，每個(gè)外泌體都有能力通過細(xì)胞表面同源受體的參與和聚集來傳遞多重組合信號(hào)，并且這種活性已被證明適用于參與生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、Wnt和Notch途徑的蛋白質(zhì)。此外，外泌體與靶細(xì)胞的融合具有將功能受體傳遞給靶細(xì)胞的能力，在某些情況下甚至激活受體和效應(yīng)物；
2）人類的生殖、懷孕和胚胎發(fā)育需要精確、精細(xì)和動(dòng)態(tài)的細(xì)胞間通信。母乳來源的外泌體具有調(diào)節(jié)胎兒免疫系統(tǒng)的功能。在母乳中，外泌體不僅促進(jìn)產(chǎn)后胎兒健康和生長(zhǎng)，母乳來源的外泌體含有具備免疫相關(guān)功能的miRNA，并在體外增加外周血來源的T調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量，可能調(diào)節(jié)免疫耐受；
3）調(diào)節(jié)免疫。外泌體的供體細(xì)胞來源多種多樣，如樹突狀細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞甚至免疫細(xì)胞本身，且同一種細(xì)胞細(xì)胞在不同生理環(huán)境下分泌的外泌體功能不同，可促進(jìn)免疫應(yīng)答，也可免疫抑制；
4）外泌體與疾病。外泌體可能在代謝性疾病的出現(xiàn)以及心血管健康中發(fā)揮作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們可以轉(zhuǎn)移代謝產(chǎn)物，并通過小鼠和人類的胰腺b細(xì)胞、脂肪組織、骨骼肌和肝臟之間的外泌體miRNA交換促進(jìn)細(xì)胞間通訊；外泌體可以參與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的清除，從而發(fā)揮解毒和神經(jīng)保護(hù)功能，進(jìn)而在退行性疾病中發(fā)揮作用；與外泌體在其他疾病中的作用的研究相比，外泌體對(duì)癌癥的研究進(jìn)展迅速，外泌體影響腫瘤形成、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、副腫瘤綜合征和對(duì)治療的耐藥性。

圖 外泌體與病毒感染

外泌體臨床應(yīng)用：

1）疾病診斷。外泌體存在于所有生物液體中，由所有細(xì)胞分泌，使其作為微創(chuàng)液體活檢具有吸引力，并有可能進(jìn)行縱向采樣以跟蹤疾病進(jìn)展。外泌體診斷應(yīng)用的焦點(diǎn)疾病包括心血管疾病、影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的疾病和癌癥；
2）載體制備。與脂質(zhì)體相反，外泌體具有良好的耐受性，在小鼠外源性給藥時(shí)可以以最小的免疫清除率遞送功能性藥物；

3）治療作用。間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可以發(fā)揮治療作用，并且在治療移植物抗宿主疾病患者中的應(yīng)用表明，重復(fù)注射具有良好的耐受性，不會(huì)產(chǎn)生顯著的副作用。

外泌體研究中的樣本制備：

圖 外泌體研究中的樣本類型

外泌體研究中的樣本涉及血液、尿液、乳汁、唾液、腦脊液及細(xì)胞培養(yǎng)上清，整體的原則是去除細(xì)胞、新鮮樣本、低溫保存（-80℃）。

細(xì)胞培養(yǎng)上清液中外泌體提取和純化：

所需試劑：無外泌體胎牛血清（abs993）、細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒（abs50040）、外泌體專用無血清培養(yǎng)基（abs9430）/外泌體專用無血清培養(yǎng)基（含生長(zhǎng)因子）（abs9774）

圖 無外泌體胎牛血清 （abs993）

1）選取細(xì)胞狀態(tài)良好的代次，在細(xì)胞匯合度達(dá)到60%左右時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基（abs9430）或者含無外泌體血清（abs993）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞上清液；
2）先用800~1000g左右的離心力10min有效去除細(xì)胞殘留，取上清后，再3000g離心10min有效去除細(xì)胞碎片物，去除細(xì)胞碎片的離心上清液轉(zhuǎn)移到新的50mL離心管中；
3）在去除雜質(zhì)的離心上清液中加入Exosome Concentration Solution（ECS試劑），20mL上清液加入5mL ECS試劑；
4）加入ECS試劑后將離心管蓋緊，通過渦旋振蕩器混勻1min，再放置于 4℃靜置至少2h；（增加靜置時(shí)間可提高外泌體得率，但靜置時(shí)間不可超過24h）
5）取出裝有混合液的離心管于4℃以10000g離心60min，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒；（注：盡可能吸凈上清液）
6）外泌體重懸：取1×PBS均勻吹打離心沉淀物（具體加入劑量如下表），待其溶解后，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的5mL離心管中；
7）將含有重懸液的5mL離心管于4℃以12000g離心2min，保留上清液，該上清液中富含外泌體顆粒；（注：若沉淀較多，可12000g/2min 離心多次至無明顯沉淀，每次取離心上清液）
8）純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉(zhuǎn)入Exosome Purification Filter（EPF柱）上室中，于 4℃以3000g離心10min，離心后收集EPF柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒；（注：EPF柱不可重復(fù)使用）

9）外泌體的保存： 純化后的外泌體以50-100μL進(jìn)行分裝保存于-80℃低溫冰箱中，以備后繼實(shí)驗(yàn)使用，外泌體保存液（2×）（abs9776），能夠?qū)⑼饷隗w在4℃條件下保存至少6個(gè)月，適用于液態(tài)及凍干形態(tài)，能夠有效降低凍干對(duì)外泌體的負(fù)面影響。

注意事項(xiàng)：

1）在收獲細(xì)胞時(shí)，盡量保證死細(xì)胞數(shù)量不超過5%，因?yàn)榈蛲?、死亡的?xì)胞會(huì)分泌凋亡小體，從而對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體造成污染；
2）如果后期要將提取的外泌體進(jìn)行共孵育或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，需要用2um的濾器對(duì)外泌體進(jìn)行除菌；
3）細(xì)胞上清樣品越早處理越好，長(zhǎng)時(shí)間放置，含有的細(xì)胞破裂，胞內(nèi)囊泡釋放也會(huì)對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體產(chǎn)生污染；
4）不能用DMEM、1640、F12 這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基替代血清或者外泌體專用無血清培養(yǎng)基呢，細(xì)胞在這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的環(huán)境下，是處于饑餓狀態(tài)的，細(xì)胞會(huì)將培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)全部消耗掉的，這時(shí)的上清液中的外泌體含量會(huì)大幅度下降。

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[2] Kalluri R, LeBleu V S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes[J]. Science, 2020, 367(6478): eaau6977.

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