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背景介紹：

自從2013年榮獲諾貝爾獎(jiǎng)后，外泌體就一直是國(guó)際科研界的研究熱點(diǎn)。近十年來(lái)，它的熱度一直居高不下，如今依然穩(wěn)坐在國(guó)自然熱點(diǎn)排行榜的第五名！讓我們繼續(xù)揭開這個(gè)細(xì)胞外囊泡的神秘面紗！

外泌體個(gè)人名片：

姓   名：外泌體 (Exosome) ；

種   屬：細(xì)胞外囊泡；

大   小：直徑30-150nm；

密   度：1.1-1.18g/mL；

形   狀：呈“茶托狀"；

來(lái)   源：由所有活細(xì)胞分泌；

存   在：幾乎存在于所有的組織、細(xì)胞間隙、體液中；

數(shù)   量：人體中大約有10¹⁴個(gè)，近乎于平均每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生1000-10000個(gè)；

功   能：調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、控制炎癥、促進(jìn)血管新生、促進(jìn)組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、癌癥的發(fā)生發(fā)展、抗原呈遞等；

榮   譽(yù)：獲得2013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

攜帶物質(zhì)：脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和RNA (miRNA、lncRNA、circular RNA、mRNA) ；

突出特性：異質(zhì)性，即同一種細(xì)胞分泌的外泌體都有可能具有很大的功能區(qū)別；

圖 外泌體結(jié)構(gòu)與特征

外泌體的特性及相關(guān)應(yīng)用：

1、異質(zhì)性，可作為生物標(biāo)記物，用于疾病診斷

不同細(xì)胞分泌的外泌體在數(shù)量、細(xì)胞膜與內(nèi)容物成分、生物學(xué)功能都有所不同，具有異質(zhì)性；外泌體的大小和含量可反映分泌細(xì)胞的類型和狀態(tài)，并能精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)體內(nèi)的各種生理活動(dòng)，可作為生物標(biāo)志物用于疾病診斷。通過分離、提純體液中的外泌體，分析其內(nèi)含的特征miRNA或蛋白質(zhì)等，再通過與疾病特征標(biāo)志物進(jìn)行比對(duì)就能判斷疾病類型。

2、呈遞性，可用于免疫調(diào)控

外泌體一般通過傳遞多種生物分子完成抗原呈遞、免疫活化抑制及免疫耐受過程。其中，抗原呈遞細(xì)胞分泌的外泌體能攜帶并呈遞相關(guān)復(fù)合物，通過減弱或增強(qiáng)免疫反應(yīng)達(dá)到免疫治療的目的。此外，外泌體還裝載著諸多免疫相關(guān)分子，包括溶酶體相關(guān)膜蛋白1和2、免疫球蛋白超家族成員8及MHC ，可特異性結(jié)合相關(guān)肽鏈、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。

3、脫免性，可作為藥物遞送載體

外泌體具有免疫原性低特點(diǎn)，可逃逸大部分免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊。相較于傳統(tǒng)化學(xué)藥物的生物相容性差、易被人體清除、溶解度及滲透性差等缺點(diǎn)，外泌體具有諸多優(yōu)勢(shì)如：納米尺度的體積、低細(xì)胞毒性、良好的生物膜透膜性和生物相容性，且其脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)可保護(hù)內(nèi)容物不被降解，維持生物活性。因此，外泌體可作為載體遞送藥物，幫助藥物逃逸免疫系統(tǒng)、跨越組織屏障，提高藥物遞送和吸收效率。

4、促瘤性，可應(yīng)用于腫瘤治療

腫瘤細(xì)胞來(lái)源外泌體的促瘤性表現(xiàn)為在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的同時(shí)，也會(huì)向受體細(xì)胞傳遞有害信息，導(dǎo)致細(xì)胞病變；并且，腫瘤細(xì)胞還會(huì)通過分泌外泌體將一部分藥物排出細(xì)胞或與功能性藥物抗體結(jié)合，降低藥效、產(chǎn)生耐藥性。諸多研究表明，晚期腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可抑制抗腫瘤的免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與擴(kuò)散。近年來(lái)，外泌體在腫瘤治療應(yīng)用方面產(chǎn)生了諸多新的干預(yù)措施，如阻止外泌體的生成、分泌和阻斷外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞通信。

5、誘導(dǎo)性，可應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)

外泌體還具有誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和分化的功能，可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 分化為不同細(xì)胞以替代受損的組織細(xì)胞，應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。如從人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中提取的外泌體可促進(jìn)細(xì)胞的增殖及遷移，抑制線粒體凋亡信號(hào)通路，從而促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的修復(fù)。許多公司已研發(fā)出基于外泌體的再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)品，涵蓋傷口再生、藥妝產(chǎn)品、美容等領(lǐng)域。

外泌體研究整體方案：

圖 外泌體整體研究方案流程圖

外泌體鑒定：

在上一期——《國(guó)自然研究熱點(diǎn)“常青樹"—外泌體介紹Ⅰ》文章中，給大家詳細(xì)介紹了外泌體提取純化的各類方法。外泌體分離純化之后，需要進(jìn)行表征鑒定，以判斷純化效果，并評(píng)估獲得的外泌體是否滿足下游實(shí)驗(yàn)的需求。對(duì)外泌體進(jìn)行表征鑒定的方法很多，分析的指標(biāo)也是多方面的，其中大小、形態(tài)、表面標(biāo)志物這三個(gè)方面的檢測(cè)是最重要的，這也是國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì) (ISEV) 建議對(duì)分離獲得的外泌體必須進(jìn)行的表征鑒定方法。

1、外泌大小/形態(tài)鑒定—電子顯微鏡

掃描電鏡 (SEM) 或透射電鏡 (TEM) 等電子顯微鏡可以直觀的看到粒子的形態(tài)，因此可以用于鑒定外泌體的存在和完整性。操作步驟大致是：用PBS重懸提取的外泌體，滴于孔徑2nm的載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置2min，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負(fù)染5min，濾紙吸干負(fù)染液，室溫晾干，電鏡觀察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~150nm大小不一的茶托或杯狀結(jié)構(gòu)（也會(huì)有200nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體）。

圖 電子顯微鏡檢測(cè)外泌體形態(tài)

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2、外泌體粒徑/濃度檢測(cè)—納米顆粒示蹤分析 (NTA)

NTA技術(shù)可檢測(cè)外泌體的粒徑和數(shù)量，其操作步驟是：將收集的外泌體用PBS稀釋至10⁶ 個(gè)/mL，用1mL注射器注入納米顆粒跟蹤分析儀；激光光束穿過樣本室外泌體顆粒，通過裝有攝像頭的顯微鏡實(shí)現(xiàn)顆?？梢暬?，捕捉外泌體的布朗運(yùn)動(dòng)，最后利用方程式根據(jù)其運(yùn)動(dòng)計(jì)算濃度和流體力學(xué)直徑。相較于其他外泌體鑒定方式，NTA技術(shù)的樣本處理更簡(jiǎn)單，更能保證外泌體原始狀態(tài)，檢測(cè)速度更快。

圖 NTA檢測(cè)外泌體粒徑/濃度

3、外泌體表面標(biāo)志物鑒定—WB檢測(cè)

對(duì)外泌體生化方面的分析鑒定主要是對(duì)其所攜帶的特異性蛋白標(biāo)記物的檢測(cè)，WB檢測(cè)是一種常見的外泌體特定蛋白（如四跨膜蛋白、腫瘤易感基因101蛋白﹑脂筏標(biāo)記蛋白、凋亡誘導(dǎo)因子6相互作用蛋白等）分析技術(shù)。具體操作參考標(biāo)準(zhǔn)WB操作，利用外泌體特異性蛋白的抗體進(jìn)行標(biāo)記，從而對(duì)外泌體進(jìn)行定性檢測(cè)分析。

圖 WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白

還有其他方法可以用于鑒定外泌體，如ELISA、流式細(xì)胞術(shù)及質(zhì)譜也常用于檢測(cè)外泌體的數(shù)量及表面標(biāo)志蛋白如CD9、CD63、CD81的表達(dá)。

外泌體定量檢測(cè)試劑盒介紹：

愛必信ELISA夾心法檢測(cè)外泌體含量試劑盒(abs50054)，利用高性能抗CD9捕獲和抗CD81檢測(cè)抗體，可用于檢測(cè)人體體液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液，靈敏和定量地檢測(cè)共表達(dá)外泌體表面標(biāo)記CD9和CD81的靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)樣本中完整外泌體的快速精準(zhǔn)定量。

圖 外泌體定量檢測(cè)試劑盒原理

產(chǎn)品組分：

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、試劑配制

1）所有試劑應(yīng)在使用前室溫平衡至少15min；

2）取濃縮洗液，用蒸餾水或去離子水將20X濃縮洗液稀釋成1X工作液，混勻備用；

3）顯色底物液在檢測(cè)前A和B按1:1混勻使用。

2、實(shí)驗(yàn)過程

1）準(zhǔn)備板條，試劑充分搖勻；

2）用移液槍分別取100μL標(biāo)準(zhǔn)品SO-S5，待測(cè)樣品分別加入微孔板；

3）用封板膜封好板孔，37℃，60min；

4）工作液洗液清洗3次，每次300-350μL/孔，在吸水紙上拍干板孔中殘留液體；

5）每孔加入100μL酶結(jié)合物；

6）用封板膜封好板孔，37℃，60min；

7）工作液洗3次，每孔300-350μL/孔，在吸水紙拍干；

8）向反應(yīng)孔加入100μL顯色底物液工作液，37℃避光反應(yīng)30min，加入50μL終止液，酶標(biāo)儀450nm下讀數(shù)，并繪制XY線性曲線。

3、校準(zhǔn)程序

XY線性擬合，其線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，每次實(shí)驗(yàn)都要做全套校準(zhǔn)品，繪制曲線。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 南德. 脂肪干細(xì)胞外泌體的分離鑒定及遞送姜黃素的體外抗肝癌研究[D].大連理工大學(xué),2021.DOI:10.26991/d. c nki.gdllu.2020.001248.
 

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