細胞培養(yǎng)是指在人工創(chuàng)造的與體內生長環(huán)境相似，如無菌條件、適宜的溫度、pH、CO2環(huán)境和適宜營養(yǎng)條件下，使細胞生長、繁殖并維持主要結構和功能的技術。
細胞培養(yǎng)是細胞生物學研究方法中很常用也是最重要的技術之一，在現(xiàn)代醫(yī)學、生物科學、農業(yè)科學等領域被廣泛應用以提供研究模型和實驗材料。在細胞培養(yǎng)過程中，wan全培養(yǎng)基對細胞生長狀態(tài)起到關鍵作用，決定實驗成功與否。而血清是wan全培養(yǎng)基中的關鍵成分之一，除為細胞生長提供基本營養(yǎng)物質、結合蛋白、一些參與解毒代謝的微量元素和可起到中和保護的酶類之外，還可以保護細胞免受機械損傷，因此被業(yè)內認為是細胞增殖過程中最重要的試劑。在生命科學領域的細胞培養(yǎng)技術中，動物血清的應用十分廣泛，特別是牛來源血清。而牛源血清又分為胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，它們的區(qū)別方式主要由于牛齡和采血方式不同，其中胎牛血清因其抗體水平含量低對后續(xù)實驗結果影響小、生長因子含量水平高利于細胞增殖而應用很廣。因此關注胎牛血清的品級、質量以及使用過程的一些注意事項，會對實驗結果起到直接影響作用，并可以確?？蒲腥藛T在實驗操作過程中的安全性。
今天我們就來看看在細胞培養(yǎng)過程中血清使用方面常見的問題，如：血清儲存條件、如何程序解凍、細胞污染與血清之間的關系、傳說中的“黑膠蟲"是什么以及血清熱滅活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器"，通過今天的解析與學習可以讓我們在做細胞培養(yǎng)相關實驗時事半功倍！那我們就開始吧~
Q1：血清長期儲存的條件和方法是什么？
A1：血清如需長期保存，則必須儲存于-10℃或更低溫冰箱中，建議存放于-20℃的冰箱中。研究表明儲存在-80℃條件下的血清在性能方面變化不大，但由于解凍時溫差過大，會導致析出更多沉淀，使得背景雜亂，因此血清長期保存不建議處于-80℃條件下。如果近期會頻繁使用血清，我們建議不要在4℃條件下存放超過1個月，若一次無法用完整瓶建議分裝后保存，且要避免反復凍融。另外，血清冰凍后體積會增加約10%，因此血清分裝時請留意預留一定的體積空間。
Q2：如何進行血清的程序性解凍？血清才不會使產品質量受損？
A2：程序性解凍血清可以確保血清制品質量的穩(wěn)定性，且不會因為溫差過大而析出過多蛋白等沉淀。程序性解凍方法是于實驗開始之前將冷凍的血清置于4℃冰箱中融解，并且在解凍過程中每隔1小時搖勻一次，使溫度與成分均一，減少沉淀析出，直至全部解凍，然后再移入室溫條件下使用。
Q3：血清解凍后發(fā)現(xiàn)絮狀沉淀該如何處理？
A3：造成血清發(fā)生絮狀沉淀的原因主要是血清解凍過程中溫差帶來了脂蛋白變性和纖維蛋白析出，沉淀本身不會影響血清質量，也不會對實驗結果造成影響。但如必須處理沉淀，則可通過離心方式去除，如500-1000×g離心5-10min。
Q4：血清沉淀是什么？
A4：用于細胞培養(yǎng)的胎牛血清及其他血類制品中均存在各種類型的沉淀，如纖維蛋白和磷酸鈣等。一些絮狀沉淀主要就是纖維蛋白，通常我們肉眼可見，大小在1-2mm之間；而磷酸鈣在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)布朗運動的小黑點，通常被誤認為是微生物污染。血清沉淀往往比較難以預測和控制，但幸運的是這些沉淀不會影響血清品質。
Q5：血清中的小黑點是“黑膠蟲"么？
A5：血清解凍過程溫差過大、經反復凍融或通過熱滅活處理后更容易產生沉淀，這些沉淀物在鏡下觀察時有一些會呈現(xiàn)以布朗運動的小黑點，業(yè)內流行一種“黑膠蟲"污染的說法，但“黑膠蟲"一直以來都是極為神秘的存在，至今科學家們也沒有完整的實驗結果可以證實它究竟是一種生物還是非生物，更有人認為“黑膠蟲"是血清的原蟲，或誤以為是細菌或真菌污染。但科學家通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)它們更可能是血清中的蛋白結晶。這種結晶可能為蛋白析出，如纖維蛋白原凝結成纖維蛋白；或是鹽析出，如磷酸鈣等；也有一些是膽固醇和脂肪酸。以下圖片就證實了這一說法，如纖維蛋白和磷酸鈣。
圖1：上圖分別為纖維蛋白在低倍鏡和高倍鏡下觀察到的圖像，下圖為磷酸鈣在低倍鏡和高倍鏡下觀察到的圖像（箭頭指示的是我們看到的“黑點"）
Q6：如何判斷血清污染？
A6：
（1）首先檢查并判斷外包裝是否有破損，一般瓶身破損的血清發(fā)生污染的可能性極大；
（2）將血清接種到血酯板上，培養(yǎng)后看是否有菌落形成；
（3）可通過質量檢測試劑盒檢測結果判定，如支原體檢測試劑盒等。血清污染主要包括細菌污染、真菌污染和支原體污染。在細胞培養(yǎng)時想要確定血清存在細菌污染，可嘗試使用5-10倍濃度青鏈霉素雙抗沖擊培養(yǎng)24-48h；真菌污染的細胞無法搶救，應立即將細胞瓶進行高壓滅菌處理，并消毒培養(yǎng)箱；支原體污染可考慮更換早期代次細胞，或使用商品化支原體去除試劑。
Q7：細胞形態(tài)不正常、生長狀態(tài)異?；蛟鲋乘俾示徛欠衽c血清有關？
A7：細胞形態(tài)異常需要綜合關注細胞代次、傳代操作、培養(yǎng)基和血清等諸多因素。如傳代次數(shù)過多或傳代時間過晚都有可能影響細胞的生長狀態(tài)。有些細胞對血清具有一定適應性，更換新批次血清時可能出現(xiàn)所含因子水平的差異而導致的細胞生長狀態(tài)受到影響的現(xiàn)象，可以通過血清梯度替換或者增加細胞適應時間來解決此類問題。與此同時也要關注基礎培養(yǎng)基和傳代操作等方面是否存在一定問題。
Q8：如何做血清的梯度替換？
A8：當細胞培養(yǎng)實驗需更換血清品牌時，做程序性梯度替換方案尤為重要，因為不同品牌的血清所含成分有所差異，血清更換會使細胞發(fā)生不適，從而出現(xiàn)細胞增殖緩慢或細胞狀態(tài)不佳等情況。建議的梯度替換方法為：wan全培養(yǎng)基配置過程中先用25%新血清與75%原血清進行混合，培養(yǎng)傳代1-2次；而后用50%新血清與50%原血清混合培養(yǎng)傳代；再用75%新血清與25%原血清混合培養(yǎng)傳代；最后wan全使用新血清培養(yǎng)傳代。
Q9：培養(yǎng)基中添加血清和抗生素后可長期保存嗎?
A9：新鮮培養(yǎng)基中添加血清和抗生素后，建議在2周內使用完。
Q10：血清的熱滅活是必須的嗎?
A10：實驗表明，經熱滅活處理的血清對細胞生長可能僅有微小促進或wan全沒有任何作用，甚至通常因高溫處理而損失掉血清中部分營養(yǎng)成分從而影響血清質量，造成細胞生長速率降低。熱滅活過程中因局部溫度過高、搖晃不均勻或滅活時間過長，都會造成血清品質下降，且經熱滅活后的血清會增加發(fā)生蛋白沉淀概率。因此，若非必須血清不需要做熱滅活，而少數(shù)對補體敏感的細胞實驗，如某些免疫學實驗或腺病毒包裝等，可酌情對血清進行熱滅活操作。
Q11：血清熱滅活應如何操作？
A11：
（1）熱滅活前，必須先將解凍后的血清搖勻，并恢復至室溫；
（2）取部分搖勻血清置于50ml離心管中，并準備同規(guī)格對照管一個；
（3）對照管內加入血清等體積水；
（4）對照管內插入溫度計進行溫度預試，當溫度達到56℃時將恢復至室溫的血清放入水浴鍋30min；
（5）滅活過程中需要每隔5min輕輕晃動搖勻，以保證溫度均一。
Q12：血清為什么存在批間差？
A12：血清批間差是客觀存在的，因為血清制品來源于天然活體，供體牛只的生理狀況、健康狀況均不同，且受飼養(yǎng)環(huán)境的地形、風貌、飲食、水源等影響，體內各類蛋白、生長因子和酶類的含量均有巨大差異，所以血清具有含量復雜且不固定的特性，批間差異在所難免，因此批間差異小的血清不僅可以保證血清質量，確保細胞培養(yǎng)效果，還能減少由于批間差異帶來的使用前測試，且避免實驗結果的不可重復性。
既然血清在細胞培養(yǎng)過程中如此重要，那么我們又該如何選擇靠譜的血清呢？
1.中國海關允許進口的血源地
世界動物衛(wèi)生組織（OIE）對國家或地區(qū)動物感染性疾病有相關評價指標，如瘋牛病風險評價指標GBR就是根據(jù)瘋牛病風險等級進行地域性風險評估及分類。目前世界上僅有一些少數(shù)國家在OIE對牛類風險性疾病的評估中符合中國海關要求，因此中國海關允許進口的血清來源地有澳大利亞、新西蘭、烏拉圭，這些國家來源的牛血類制品的生物安全等級較高，科研人員在使用相關來源的血類制品時極大降低了感染疾病的風險。
2.血源可溯性
由于血清利潤價值高昂、血源緊缺、不同原產國血清價格有差異、通過偽造血清來源從而進行利潤賺取使血清用戶深受困擾等原因，使得血源可溯源至關重要。目前血清行業(yè)中有Oritain指紋識別技術，該技術可為每批血清進行來源溯源認證，有效證實血清產品來源。
3.國際機構認證
國際血清行業(yè)協(xié)會（ISIA）成立于2006年6月，旨在建立全球動物血清和動物源性產品質量標準，促進和確保血清和動物源性產品供應符合標準和倫理規(guī)范，現(xiàn)已成為血清行業(yè)規(guī)范及血清供應商身份驗證標準的制定者。ISIA實施了供應鏈可追溯性的行業(yè)標準，這對確保血清各個批次的質量、安全性和重復性起了關鍵作用。該組織在胎牛血清生產過程中主要對原料采集、血清加工、產品質檢和出國運輸?shù)拳h(huán)節(jié)進行監(jiān)控及認證。
4.進口合規(guī)性
合規(guī)的進口血清應該具備多項資質證明文件，包括原產地證明、衛(wèi)生證/健康證/農業(yè)部非疫區(qū)證明、進口貨物報關單以及入境貨物檢驗檢疫證明。其中原產地證明（CERTIFICATE OF ORIGIN）可以追溯貨物原產地或制造地，衛(wèi)生證/健康證/農業(yè)部非疫區(qū)證明（ HC, HEALTH CERTIFICATE, TES/BSE）可以確保血清供體來源是健康、非疫區(qū)和無傳染病的。
5.嚴格質控
由于牛血清在人用疫苗和獸用疫苗等生物制藥生產中非常重要，很多國家都將其納入藥典，在我國的中華人民共和國藥典Ch.P、美國藥典USP和歐洲藥典EP中都規(guī)定了牛血清的定義和質量標準，如內毒素、總蛋白含量、血紅蛋白、PH、微生物、免疫球蛋白、抗生素等。此外，9種牛類傳染性疾病的檢測結果也十分重要，分別是牛呼吸道融合病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、 牛細小病毒(BPV)、藍舌病毒(BTV)、 牛腺病毒(BAdV)、狂犬病毒(RABV)和呼吸道腸道病毒(REO)等，這些病毒部分是人畜共患病，病毒檢測不合格的血清甚至會影響科研人員的健康與安全。因此我們要選擇質控標準嚴格按照各國藥典要求，并遵循FDA頒布執(zhí)行的cGMP規(guī)范生產流程的血清供應商，可在血清生產等各個環(huán)節(jié)保證產品質量。
6.批間差異小
批間差異小的血清不僅可以保證血清質量，確保細胞培養(yǎng)效果，還能減少由于批間差異帶來的使用前測試，且避免實驗結果的不可重復性。
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