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Wsetern Blot可以說是科研人的必修課，已經(jīng)修煉的得心應(yīng)手，但是遇到磷酸化蛋白的WB卻開始痛苦面具，一問一個不吱聲，接下來小愛帶大家深度剖析磷酸化蛋白的WB是怎么個事！

蛋白質(zhì)磷酸化修飾：

是指在激酶的催化作用下，將ATP的磷酸根基團(tuán)，轉(zhuǎn)移到蛋白的氨基酸側(cè)鏈上，這個過程一般是可逆的，可通過磷酸酶去除蛋白磷酸化修飾。蛋白的磷酸化修飾通常發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸上。蛋白質(zhì)磷酸化的修飾可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，從而影響細(xì)胞的代謝、增殖、分化等生理過程，是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、很普遍，也是最重要的機(jī)制。目前涉及到的主要研究包括，疾病機(jī)制研究、細(xì)胞信號傳導(dǎo)研究、藥物研發(fā)、發(fā)育生物學(xué)、應(yīng)激響應(yīng)等。

蛋白磷酸化示意圖

為什么磷酸化蛋白的WB不好做？

1）磷酸化蛋白的豐度通常較低，大概只有總蛋白量的10%，甚至更低；

2）蛋白磷酸化修飾可逆，細(xì)胞一旦裂解，蛋白酶和磷酸酶會立即釋放，使磷酸化蛋白質(zhì)可以在幾毫秒內(nèi)去磷酸化。

磷酸化蛋白WB，慎之又慎

1、實驗前準(zhǔn)備——充分了解自己的研究對象

一般通過查閱文獻(xiàn)或者借助數(shù)據(jù)庫了解研究蛋白的磷酸化位點及水平，這里推薦大家使用PhosphoSitePlus ——蛋白翻譯后修飾綜合性預(yù)測數(shù)據(jù)庫，只需輸入蛋白名稱，可以查詢該蛋白各種修飾類型，以及位點信息，以及其他的數(shù)據(jù)。對于表達(dá)水平較低的，可通過物理或化學(xué)方法進(jìn)行一定的刺激和誘導(dǎo)。

PhosphoSitePlus數(shù)據(jù)庫

2、樣品處理，走好第一步

1）樣品要新鮮；

2）操作要迅速；

3）試劑器具要預(yù)冷，冰上操作；

4）盡量不要用超聲波細(xì)胞破碎儀處理細(xì)胞，組織研磨要提前用液氮預(yù)冷研缽；

5）裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，缺一不可；

6）注意有的磷酸化蛋白上能不要煮沸，否則會破壞其磷酸化位點；

7）測定濃度后，加入上樣buffer，分裝，凍存于-80度，避免反復(fù)凍融。

3、內(nèi)參

需要設(shè)置兩個內(nèi)參，一個是磷酸化蛋白對應(yīng)的總蛋白，因為只檢測到磷酸化蛋白表達(dá)量的變化不能說明問題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值變化了才能說明磷酸化水平的變化；另一個是普通內(nèi)參，作為體系的對照。但是分孔上樣比較時誤差還是較大，常用的方法，是用一抗二抗去除液將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次，再壓內(nèi)標(biāo)。

CREB1磷酸化CREB1在模型大鼠PFC的表達(dá)

4、上樣，量要足

磷酸化蛋白和普通WB相比，磷酸化水平較低，所以上樣量要足。

5、封閉，看準(zhǔn)再下手

牛奶中含有一種磷蛋白即酪蛋白，會引起高背景，在進(jìn)行磷酸化蛋白檢測時建議使用牛血清白蛋白BSA或無蛋白的封閉劑。當(dāng)然如果抗體上標(biāo)注了建議，遵循建議也可以。

6、抗體孵育

因為磷酸化蛋白一抗最好4℃過夜孵育，保證抗體有充分的結(jié)合時間，4℃過夜，蛋白抗原不容易從膜上脫落。二抗則室溫1h即可。

7、洗滌，這種細(xì)節(jié)也有講究

建議初次實驗減小洗滌次數(shù)和搖床轉(zhuǎn)速，有背景總比孵不出來強(qiáng)，后期可以適當(dāng)優(yōu)化，得到比較理想的效果。

Pan B, Zhu X, Han B, Weng J, Wang Y, Liu Y. The SIK1/CRTC2/CREB1 and TWIST1/PI3K/Akt/GSK3β signaling pathways mediated by microRNA-25-3p are altered in the schizophrenic rat brain. Front Cell Neurosci. 2023 Jan 20;17:1087335. doi: 10.3389/fncel.2023.1087335. PMID: 36744005; PMCID: PMC9896578.

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