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非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)或稱為活性電泳是在不加入SDS和巰基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于酶的鑒定、同工酶分析和提純。與非變性凝膠電泳最大的區(qū)別就在于蛋白在電泳過程中和電泳后都不會變性，保證了蛋白質(zhì)功能。

為什么SDS-PAGE需要對蛋白進行變性處理？

在天然狀態(tài)下，蛋白以折疊的形式存在，且在同一分子內(nèi)同時具有正電荷和負(fù)電荷，電荷和折疊方式的不同，使具有相同分子量的不同蛋白質(zhì)在凝膠上以不同的速度遷移，這讓聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質(zhì)的分離變得困難，變形處理可以保證蛋白質(zhì)的遷移率僅取決于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量的大小。

SDS和DTT作為WB常用的試劑，有何作用？

SDS：是一種去污劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)，使折疊的蛋白質(zhì)變性成線性分子。此外，SDS以使負(fù)電荷均勻地附著蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)和SDS之間的相互作用

DTT：二硫蘇糖醇，使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂，阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間形成二硫鍵。但無法還原包埋于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先通過加熱或者變性劑等使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打開。

是否添加DTT對電泳的影響

Native-PAGE實驗方法

電泳在操作上基本和SDS-PAGE上是相同的，只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等。一般蛋白進行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白，酸性蛋白通常采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會帶負(fù)電荷，蛋白會向陽極移動；而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進行，蛋白帶正電荷，這時候需要將陰極和陽極倒置。

1、樣品準(zhǔn)備

細(xì)胞超聲即可，超聲后離心取上清，將樣品與樣品緩沖液混合，注意不要加熱樣品，以避免蛋白質(zhì)變性。上樣緩沖液(abs9830)中不能含有SDS等變性劑。

2、電泳

在非變性條件下，蛋白的遷移與蛋白的電荷、蛋白形狀以及蛋白分子量都有關(guān)。蛋白分子量的確定應(yīng)該是在不同凝膠濃度下，確定出蛋白的Rf值，繪制出凝膠濃度對Rf的曲線從而判定蛋白的分子量。

電泳的過程中，電壓過高可能引起發(fā)熱而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，所以最好在電泳槽外面放置冰塊降低溫度；如果蛋白質(zhì)的分子量較大，電泳時間可以延長，使目的蛋白質(zhì)有足夠的遷移率和其它的蛋白質(zhì)分開。

3、染色與分析

電泳完成后，將凝膠剝下，采用考馬斯亮藍(lán)染色(abs964)或銀染(abs50085)的方法觀察蛋白質(zhì)條帶。

考馬斯亮藍(lán)染色(abs964)操作方法詳見說明書

銀染操作步驟(abs50085)（需自備乙醇、乙酸和去離子水）

1）取適量樣本，開展SDS-PAGE凝膠電泳；

2）固定：將電泳后的凝膠從玻璃板上剝離下來，清水沖洗?凈，放??凈的直徑12cm玻璃皿中，加?去離?水沒過膠，蓋上蓋?，在脫色搖床上室溫?fù)u晃5min，棄掉去離?水，加?固定液沒過膠，蓋上蓋?，在脫色搖床上室溫?fù)u晃30min。

固定液配制：依次加?17.5mL?醇、3.5mL?酸和14mL去離?水，混勻后即成35mL固定液。

3）致敏：棄掉固定液，加?去離?水沒過膠，蓋上蓋?，在脫色搖床上室溫?fù)u晃5min，重復(fù)水洗?次，共2次，加?致敏液沒過膠，蓋上蓋?，在脫色搖床上室溫?fù)u晃30min。

致敏液配制：31.5mL去離?水中加?3.5mL致敏液I 、70μL致敏液II 、100μL致敏液III，混勻后使?，現(xiàn)?現(xiàn)配。

4）染色：棄掉致敏液，加?去離?水沒過膠，蓋上蓋?，在脫色搖床上室溫?fù)u晃2min，重復(fù)水洗?次，共2次，加?染色液沒過膠，蓋上蓋?，在脫色搖床上室溫?fù)u晃20min。

染色液：35mL純水?加0.35mL銀溶液，30μL顯色液Ⅱ混勻，現(xiàn)?現(xiàn)配。

5）顯色：棄掉染色液，加?去離?水沒過膠，蓋上蓋?，在脫色搖床上室溫?fù)u晃1min，重復(fù)水洗?次，共2次，加?顯色液沒過膠，在脫色搖床上室溫?fù)u晃2min左右，溶液變渾濁，棄掉液體，加?新的顯色液繼續(xù)顯色至?的條帶清晰，拍照。

顯色液：31.5mL去離?水中加?3.5mL顯色液I，15μL顯色液Ⅱ混勻，現(xiàn)?現(xiàn)配。

4、蛋白回收

根據(jù)染色結(jié)果切取含有蛋白質(zhì)的膠帶，用手術(shù)刀切碎，裝入處理過的透析袋中，加入適量的緩沖液（能維持蛋白活性的，通常與Native PAGE電泳液相同），最后把透析袋放入普通的核酸電泳槽中，并在電泳槽中加入適量的緩沖液（和透析袋中的緩沖液相同），低溫電泳2-3h，電泳完畢取出透析袋，在重蒸水或者合適的緩沖液中透析，透析完畢后濃縮。

以上為基礎(chǔ)指南，具體操作需要根據(jù)實驗條件和目標(biāo)蛋白質(zhì)的特性進行調(diào)整。

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