作為常見實驗技能之一的ELISA已經(jīng)成功逼瘋了一大批研究生：加樣加到手抽筋，拍板拍到人發(fā)瘋。為此，小愛嘔心瀝血寫了一份ELISA實驗詳解，原理、步驟、注意事項一網(wǎng)打盡，幫助各位小伙伴快速入門并精通ELISA（分為上下兩篇噢）。
ELISA實驗原理
酶聯(lián)免疫吸附試驗 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay，簡稱ELISA)， 是一種利用抗原抗體結(jié)合專一性進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法，是免疫學經(jīng)典實驗方法。ELISA可適用多種樣本類型，主要包括血清、血漿、細胞培養(yǎng)物上清液、細胞裂解物、唾液、組織裂解物和尿液等。
實驗名稱 | WB | IHC/IF | ELISA |
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定性 | √ | √ | √ |
定量 | 半定量 | 半定量 | √ |
定位 |
| √ |
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靈敏度 | 中 | 中高 | 高 |
樣本類型 | 組織 | 組織 | 血清 |
表1 ELISA與常規(guī)免疫實驗對比
ELISA實驗類型
1）直接法ELISA：將抗原固定在微孔板上，使用酶標抗體孵育抗原，最后加入酶反應(yīng)的底物進行顯色反應(yīng)，顯色產(chǎn)生信號與所結(jié)合的分析物量成正比；
2）間接法ELISA：將抗原直接固定在微孔板上，首先將不帶有標記的一抗加入微孔板，與板內(nèi)抗原特異性結(jié)合，接著加入酶標二抗識別一抗，最后加入酶反應(yīng)的底物進行顯色，顯色信號值與所結(jié)合的分析物量成正比；
3）夾心法ELISA：最常見的ELISA類型。兩種特異性抗體將抗原夾在中間，通常稱為配對的抗體對。將捕獲抗體包被在微孔板上，加入樣品后，捕獲抗體與樣本結(jié)合，然后再加入酶標記的檢測抗體，形成夾心抗體對，最后加入酶反應(yīng)的底物進行顯色反應(yīng)，顯色產(chǎn)生信號值與所結(jié)合的分析物量成正比。夾心法ELISA使用兩種抗體與抗原結(jié)合，因此特異性更高；
4）競爭法：將捕獲抗體包被在微孔板上，加入標記的抗原，該抗原可與樣本中的目標抗原競爭性結(jié)合捕獲抗體，樣品中存在的抗原越多，能夠與捕獲抗體結(jié)合的標記抗原就越少，加入底物并產(chǎn)生信號，信號值與樣品中存在的蛋白量成反比。
ELISA類型 | 優(yōu)點 | 缺點 | 適用場景 |
直接法ELISA | 操作簡單，實驗耗時短 | a)僅使用一種抗體，所以特異性不夠高 b)如果來自樣本的所有蛋白質(zhì)都被固定在孔中，則有可能出現(xiàn)高背景 | 評估抗體的親和力和特異性及研究阻斷/抑制相互作用 |
間接法ELISA | 利用二抗進行信號放大 | 二抗可能引起交叉反應(yīng) | 測定內(nèi)源性抗體 |
夾心法ELISA | a)高特異性和高靈敏度 b)與復(fù)雜的樣品基質(zhì)兼容 | a)實驗流程較長 b)配對抗體對的開發(fā)具有挑戰(zhàn)性 | 確定生物樣本中的分析物濃度 |
競爭法ELISA | 能夠定量小分子 | a)僅使用一種抗體，特異性不高 b)需要標記抗原 | 確定小分子和激素的濃度 |
表2 四種ELISA類型的比較
如何選擇合適的ELISA試劑盒
小伙伴們在了解了ELISA的原理和類型之后，是不是迫不及待要開始大展身手了，NO！最重要的ELISA試劑盒，我們還沒好好選一選呢。俗話說，兵馬未動，糧草先行，選擇一個有質(zhì)量有保障并且適合自己實驗的ELISA試劑盒，才能夠保證后續(xù)實驗的順利進行。ELISA試劑盒的選擇和抗體的選擇一樣，我們都要考慮很多因素，包括以下方面：
1）樣本種屬：一般情況，不同種屬不能通用。小鼠、人或者其他家禽的因子檢測要選擇對應(yīng)種屬的試劑盒。
2）待測因子表達水平：待測因子表達水平?jīng)Q定著我們要選擇的試劑盒的檢測限和靈敏度。
3）樣本類型：ELISA實驗可以檢測的樣本類型包括：血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清、尿液等，不同的試劑盒適配的樣本類型不同。并且不同的樣本，預(yù)處理也會有所不同。
4）文獻支持：相同的種屬，指標、靈敏度，當然會選擇發(fā)表高分文獻多的那一個啦。
5） 試劑盒類型：ELISA的試劑盒有即用型和研發(fā)型兩種，即用型里面包括實驗所需的所有試劑，適合新手；研發(fā)型試劑盒需要自己包被微孔板，勝在經(jīng)濟實惠，適合ELISA已經(jīng)做得爐火純青的熟手。
6）儀器設(shè)備：ELISA 檢測方法有很多，但在實驗室中較普遍的方法是比色、熒光和化學發(fā)光法，其中比色法又是最常見的，每個孔中的顯色量用分光光度計讀取，樣品在彼此之間進行比較，或與用已知分析物濃度制成的標準曲線進行比較。也就是說，ELISA的實驗結(jié)果需要用酶標儀在對應(yīng)的波長下檢測吸光度，一般也會使用雙波長測定（檢測波長和校正波長），所以酶標儀需要能夠設(shè)置到我們使用的兩個波長。
小愛在這里也給大家推薦兩個品牌的ELISA試劑盒，bio-techne旗下的R&D systems作為ELISA的金標準，一直致力于開發(fā)包括細胞因子、ELISA試劑盒、抗體、Luminex液相芯片、多因子檢測固相芯片在內(nèi)的免疫學和細胞生物學產(chǎn)品，可提供即用型和研發(fā)型兩種ELISA試劑盒。Absin，中國人自己的生命科學百寶箱，也能夠提供即用型的ELISA試劑盒，包含一整套完整的試劑，國產(chǎn)的價格，進口的品質(zhì)。
文中相關(guān)產(chǎn)品：
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 檢測范圍 |
Human IL-6 ELISA Kit | abs510003-96T | 9.38pg/mL-600pg/mL |
Human IL-6 ELISA Kit (Plus) | abs551103-96T | 1.56-100pg/ml |
Human IL-6 High Sensitivity ELISA Kit | abs551804-96T | 0.31-20 pg/mL |
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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