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概述

免疫細胞培養(yǎng)的六個基本流程：樣本制備、細胞分選、分型鑒定、擴增&培養(yǎng)、質量優(yōu)化、后續(xù)研究。小愛已經(jīng)給大家詳細介紹了《免疫細胞培養(yǎng)攻略之樣本制備（一）》、《免疫細胞培養(yǎng)攻略之細胞分選（二）》、《免疫細胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定（三）》、《免疫細胞培養(yǎng)攻略之擴增&培養(yǎng)（四）》、《免疫細胞培養(yǎng)攻略之質量優(yōu)化（五）》今天我們繼續(xù)來了解一下后續(xù)研究。

后續(xù)研究（Follow-Up Study）：運用流式細胞術、ELISA、細胞共培養(yǎng)等實驗技術研究免疫細胞的功能（殺傷能力、分泌細胞因子、吞噬功能、增殖能力等）。免疫細胞可以做的后續(xù)研究實在是太多了，比如：CAR-T/NK/M，腫瘤細胞與免疫細胞共培養(yǎng)、類器官免疫共培養(yǎng)，細胞因子風暴等等，小愛在這里拋磚引玉，給大家介紹3個免疫細胞研究的熱門思路：NK細胞殺傷能力鑒定、混合淋巴細胞反應、Treg體外抑制實驗。

NK細胞殺傷能力鑒定

NK作為自帶免疫記憶的自然殺傷細胞，對其殺傷功能的研究也是十分火熱。

NK細胞主要通過以下四個途徑殺傷靶細胞：

①NK細胞脫顆粒，釋放穿孔素和顆粒酶殺傷靶細胞；

②活化的NK細胞通過釋放細胞因子來殺傷靶細胞；

③通過死亡受體如Fas/FasL和TNF-α/TNFR-1途徑誘導靶細胞凋亡；

④介導ADCC作用殺傷靶細胞[1]。

圖1 NK細胞殺傷靶細胞的四種途徑

體外研究NK細胞殺傷功能主要是將NK細胞與靶細胞（通常是K562細胞）共培養(yǎng)，然后通過檢測靶細胞釋放的酶或者用CAM、CFSE標記靶細胞，通過檢測熒光，也可以通過MTT/CCK8檢測細胞數(shù)量，從而得出NK細胞的殺傷活性，也可以檢測NK細胞分泌的細胞因子或者脫顆粒指標CD107a。當然我們可以換成其他的免疫細胞和腫瘤細胞進行共培養(yǎng)。

小愛也給大家整理了步驟可以參考：

1、將用熒光染料GFP，CFSE標記的靶細胞（一般為腫瘤細胞）接種到96孔板中，不同腫瘤細胞的接種密度可以參考圖2；

圖2 用于NK和腫瘤細胞共培養(yǎng)中不同腫瘤細胞的接種密度

2、第二天，將培養(yǎng)基更換成NK細胞的培養(yǎng)體系，并按照靶細胞和效應細胞(NK)1:3的比例加入NK細胞，0-12h分別進行熒光顯微鏡拍照；

注意：靶細胞和效應細胞的共培養(yǎng)比例以及時間均需要通過預實驗確定。

圖3 不同上皮細胞系在與NK共培養(yǎng)中的累積存活曲線

表1 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格

混合淋巴細胞反應（MLR）

混合淋巴細胞反應（Mixed Lymphocyte Reaction, MLR）也稱作混合淋巴細胞培養(yǎng)，是指在抗原提呈細胞刺激下，T細胞發(fā)生增殖和活化，根據(jù)淋巴細胞反應的強度來評價組織相容性抗原差異和對異體細胞的反應能力?？梢苑譃?strong>雙向混合淋巴細胞培養(yǎng)、單向混合淋巴細胞培養(yǎng)。體外研究中，通常也會檢測T細胞分泌的細胞因子如IFN-γ、T細胞增殖抗原CD107a。

雙向混合淋巴細胞培養(yǎng)：將來自兩個不同供體的 PBMC 共培養(yǎng)，使來自兩個供體的T細胞發(fā)生雙向活化。

單向混合淋巴細胞培養(yǎng)：將從一個供體分離的 CD4+T細胞與從另一個供體分離的DC相結合，從而使 T 細胞發(fā)生單向活化。

圖4 單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體外研究示意圖

小愛以單向混合淋巴細胞培養(yǎng)為例給大家介紹實驗步驟：

1、用50μg/mL的絲lie霉素37℃處理來自供體B的PBMCs 30min，這些細胞作為刺激細胞；

2、300×g離心5min，去除絲lie霉素，按照2x10⁶個PBMCs/mL（或者磁珠分選出DC細胞）接種到24孔板(250uL)中；

3、再加入250uL來自供A的個PBMCs(2x10⁶cells/mL)（或者磁珠分選出T細胞），作為應答細胞；

4、將刺激細胞和應答細胞構成的MLR置于37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)七天；

5、7天后可以檢測應答細胞的增殖和細胞因子的分泌情況。

表2 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格

CD4+CD25+Treg和CD8+T體外抑制實驗

體外抑制實驗的優(yōu)勢在于，因為只有Tresp細胞（CD4+CD25-）或Treg細胞與免疫細胞共培養(yǎng)，所以可以直接評估Treg細胞對CD8+T細胞反應的抑制作用。除CD8+T細胞外，也可以通過改變實驗條件來評估Treg細胞對其它免疫細胞(如樹突狀細胞或自然殺傷細胞)的影響。

小愛也給大家整理了文獻中的實驗步驟，可以作為參考：

1、CD3/CD28磁珠的清洗：

1）在離心管里重懸磁珠（渦旋超過30s，或者顛倒混勻5min）；

2）將確定體積的磁珠轉移到離心管中；

3）加入等體積的PBS緩沖液含1%的HSA，或者至少1ml的體積，進行重懸；

4）把離心管放在磁力架（磁珠專用）上1min，隨后棄去上清；

5）將離心管從磁力架（磁珠專用）上轉移下來，用相同體積的PBS緩沖液含1%的HSA重懸磁珠（第二步最初體積的磁珠）。

2、取50μL CD4+CD25+Treg細胞（1×10⁵cells/孔）。每孔加50μL CD8+T細胞作為應答T (Tresp)細胞（1×10⁵cells/孔）。每孔加入已經(jīng)洗過的CD3/CD28磁珠，磁珠和細胞的比例調整為1:1 。

注意：在此步驟中，標記和建立對照孔如下：未刺激CD8+T（不含anti-CD3/CD28）；刺激的CD8+T細胞（含anti-CD3/CD28）；刺激的Treg細胞（含anti-CD3/CD28）。Treg細胞可以用wan全培養(yǎng)基稀釋，以不同比例的Tresp細胞與Treg細胞（1:0.25-1:1）共培養(yǎng)；

3、各孔加50μL或適當體積的培養(yǎng)基，總體積為200μL。用鋁箔蓋住板子，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)72h；

4、培養(yǎng)72h后進行細胞因子產(chǎn)生分析，將每孔上清液分離到另一個板上，進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，檢測IFN-γ水平；

5、將每孔上清液分離后，用FACS緩沖液清洗含有細胞的培養(yǎng)皿，4°C，300g離心2min，洗3次；

6、洗滌后，棄去上清。用50μL的抗體緩沖液（anti-CD4、anti-CD8和細胞活力檢測試劑）重懸細胞，對增殖的CD8+T細胞進行染色（在獲得CD8+T細胞時，可使用追蹤細胞增殖的染料進行標記）。4°C避光孵育20min；

7、4°C，300g離心2min，洗兩次。洗滌后，棄上清，用100μL固定緩沖液4℃避光固定20min；

8、4°C，300g離心2min，洗兩次。200μL FACS緩沖液重懸細胞，流式細胞術檢測標記CD8+T細胞增殖情況。

圖6 活化的Treg細胞抑制CD8+T細胞的增殖以及分泌IFN-γ

今天講解就到這了，大家如有細胞培養(yǎng)問題，歡迎一起交流哦！

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