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TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit（FITC）細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體 DNA 的降解， 這是一個較普遍的現象。這種降解非常特異并有規(guī)律，所產生的不同長度的 DNA 片段約為 180 bp-200 bp 的整數倍， 表現為瓊脂糖凝膠電泳中呈現特異的梯狀 Ladder 圖譜，本試劑盒采用 TUNEL 法，應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡細胞斷裂 DNA 的 3′-OH 末端催化摻入 FITC-dUTP 。 FITC-dUTP 標記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。TUNEL 法可以選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞。TUNEL 實驗中， TdT 酶催化 dUTP 摻入 斷裂的 DNA 鏈的 3′-OH 末端。抗原標記的 dUTP（如 digoxin-dUTP、生物素-dUTP），因為它可以直接進行原位檢測，是一種更快速、直接的檢測手段。

TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit（FITC）實驗材料（自備） 
PS 緩沖液（pH~7.4） 
4%多聚甲醛（in PBS） 
牛血清白蛋白 (BSA) 或正常的羊、牛血清 
70%乙醇（自選） 
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本） 
實驗步驟：
1、樣本準備： 
1.1 細胞樣品
1) 可選：準備一份陰性對照樣本（加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反應液）。
2) PBS 清洗細胞兩次。 
3) 細胞固定：加入適量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液，4℃ 放置 30 min。 
4) PBS 清洗細胞兩次。 
5) 通透細胞：加入冰上預冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h。 細胞能在 70%乙醇中-20℃的條件下保存一周?；蛘呒毎捎门渲朴?PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室溫放置 20 min。 
6) PBS 清洗細胞兩次。 
1.2 石蠟組織切片
1) 室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片 2 次，每次 5 min，以*脫掉石蠟。 注：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風櫥中進行此操作。 
2) 室溫下，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗 2 次，每次 5 min。 
3) 室溫下，將切片樣本連續(xù)浸沒在不同濃度梯度的乙醇 （95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂洗 1 次，每 次 5 min。 
4) 室溫下，將切片浸沒于純水中漂洗 1 次，每次 3 min，再將切片浸沒于 1×PBS 中漂洗 1 次，每次 3 min，用濾紙小心 吸干切片樣本周圍多余液體。 
5) 用免疫組化筆在切片樣本周圍描繪樣品輪廓，以便下游通透與標記。 
6) 按 1:100 的比例，將 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀釋，使其終濃度為20 µg/mL。每個樣本上滴加100 µL 稀釋好的 Proteinase K 溶液，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育 20 min。（Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優(yōu)化）。 
注：蛋白酶 K 可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導致切片脫落，所以要*化孵育時間長短。時間一般為 10~30 min，4 µm 左右的片子可以用 10 min，但 30 µm 左右的可用 30 min。過長易脫片、過短起不到通透效果。 
7) PBS 浸潤清洗切片兩次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。 
注：這一步必須把蛋白酶 K 洗滌干凈，否則會嚴重干擾后 續(xù)的標記反應。 
1.3 冰凍組織切片
1) 將冰凍切片放置于室溫的片架上，室溫 20 min，晾干。 
2) 將載玻片浸沒在 4%多聚甲醛溶液（in PBS）中，室溫固定 30 min。 
3) PBS 浸潤清洗切片兩次，每次 5 min。 
4) 用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。 
5) 按 1:100 的比例，將 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀釋，使其終濃度為20 µg/mL。每個樣本上滴加100 µL 稀釋好的 Proteinase K 溶液， 使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育 10 min。Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優(yōu)化）。 注：蛋白酶 K 可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導致切片脫落，所以要*化孵育時間長短。時間一般為 10~30 min，4 µm 左右的片子可以用 10 min，但 30 µm 左右 的可用 30 min，需摸索最佳時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。 
6) PBS 浸潤清洗切片兩次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。 
1.4 陽性處理(僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行TUNEL 反應步驟)
1) 按 1:10 的比例用 ddH2O 將 10 × DNase I Buffer 稀釋成 1 × DNase I Buffer 備用。 
2) 滴加 100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的樣本上，室溫平衡 5 min。 
3) 用 1 × DNase I Buffer 以 1:100 稀釋 DNase I (2 U/μL)， 使其為終濃度 20 U/mL 的工作液。 
4) 輕輕吸掉多余液體，加入 100 μL 濃度為 20 U/mL DNase I 工作液，室溫孵育 10 min。 
5) 輕輕吸掉多余液體，PBS 清洗樣品 2 次。 
2. TUNEL 反應 
1) 每個樣本加入 100 μL TUNEL 平衡緩沖液，孵育 5 min。 
2) 預先配制 TUNEL 反應混合液：每個樣本需要已加入 1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反應緩沖液。 
3) 棄去平衡緩沖液，用濾紙小心吸去切片樣本周圍的多余液體，每個樣本加入 50 μL TUNEL 反應混合液。 
a) 貼壁細胞，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育 60 min。 
b) 懸浮細胞，可加入微孔板中，采用微孔板振蕩器進 行孵育或每隔 15 min 溫和的震蕩反應管，使之充分反應。 37℃避光孵育 60 min。 
c) 組織樣本，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。將樣本平放于濕盒內，37℃恒溫箱孵育 2 小時，濕盒底部鋪一張含少量水的紙巾保持濕度。37℃避光孵育 2 h。 
4) 去掉反應液，在 1×PBS 的染色缸中浸泡潤洗 2 次，每次 5 min。再使用適量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100，其中含 5 mg/mL BSA 的緩沖液清洗樣本 3 次，每次 5 min，以降低背景。
5) （可選）復染：每個樣本滴加濃度為 2 μg/mL 的 DAPI 染液，避光室溫孵育 10 min。染色完后，輕輕去掉染液，并將樣本在 1×PBS 中浸泡潤洗 3 次，每次 5 min。 
6) （可選）封片：將切片樣本先純水浸沒 5 min，再放入 70%乙醇浸沒 5 min，再 80%乙醇浸沒 5 min，90%乙醇浸沒5 min，95%乙醇浸沒 5 min，無水乙醇浸沒 5 min，最后將切片樣本置于染色缸中以新鮮的二甲苯浸泡透明化處理 2 次，每次 5 min。（通風廚中操作）。脫水完成后，擦去切片周圍的液體，每個切片樣本滴加 50 μL 抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片*。 
7) 用熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察、分析，FITC是一種綠色熒光染料，激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為 485 nm，515 nm （凋亡細胞應被標記上明亮的綠色熒光，沒有加入 TdT 酶的陰性對照樣本未被標記上熒光）。

1、熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
2、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴口罩、手套操作，接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒-FITC

本產品應置于-20℃儲存，組分B需避光，避免反復凍融。