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描述：

線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針?？梢詸z測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以 產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過JC-1從紅色熒光 到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠 色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。JC-1單體的最大激發(fā)波長為515nm，最大發(fā)射波長為529nm；JC-1聚合物的最大 激發(fā)波長為585nm，最大發(fā)射波長為590nm。實際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光 的設(shè)置即可。本試劑盒提供了CCCP作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100個樣品；對于12孔中的樣品，本試劑盒共可 以檢測200個樣品。

使用方法：

1、JC-1染色工作液的配制
六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推：對于細(xì)胞懸液每50～100萬細(xì)胞需0.5mLJC-1染色工作液。取適量JC-1（200×），按照每50μLJC-1（200×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mLJC-1染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1染色工作液。

2、陽性對照的設(shè)置：
把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照1∶1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細(xì)胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-1，進行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常10μMCCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會喪失，JC-1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻資料決定。

3、對于懸浮細(xì)胞
取10～60萬細(xì)胞，重懸于0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。
加入0.5mLJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。
在孵育期間，按照每1mLJC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
37℃孵育結(jié)束后，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。
用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。
再加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細(xì)胞儀分析。

4、對于貼壁細(xì)胞
注意：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細(xì)胞儀檢測，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。
對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1mL細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。加入1mLJC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。
在孵育期間，按照每1mLJC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。
加入2mL細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對于純化的線粒體
把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液（1×）稀釋5倍。
0.9mL5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100μg純化的線粒體。用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（timescan），激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為485nm時，可以在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設(shè)置進行熒光檢測。
用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6、熒光觀測和結(jié)果分析檢測
JC-1單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm；檢測JC-1聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時的設(shè)置；檢測JC-1聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

注意事項：

1、JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
2、必須先把JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入JC-1染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×），這樣JC-1會很難充分溶解，會嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。
3、裝載完JC-1后用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌時，使JC-1染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時的洗滌效果較好。
4、JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。
5、請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。
6、如果發(fā)現(xiàn)JC-1染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進溶解可以在37℃加熱。
7、CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。
8、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

產(chǎn)品引用文獻：

Cold atmospheric plasma fumigation suppresses postharvest apple Botrytis cinerea by triggering intracellular reactive oxygen species and mitochondrial calcium

Jiankang Cao, Qiong Fang, Chenrui Han, Chongshan Zhong

INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY. 2023 Sep 11 .

影響因子： 5.4

SNORC knockdown alleviates inflammation, autophagy defect and matrix degradation of chondrocytes in osteoarthritis development

Tang Zhifang, Feng Hanzhen, Chen Xusheng, Shao Shuiyan, Li Chuan

MOLECULAR AND CELLULAR BIOCHEMISTRY. 2023 Sep 02 .

影響因子： 4.3

Water Extract of Rice False Smut Balls Activates Nrf2/HO-1 and Apoptosis Pathways, Causing Liver Injury

Zhang Guomei, Li Han, Liu Shanshan, Zhou Xuming, Lu Mingyang, Tang Liang, Sun Lihua

Rice Science. 2023 Aug 23 .

影響因子： 4.8

The novel polyfluoroalkyl benzenesulfonate OBS exposure induces cell cycle arrest and senescence of rat pituitary cell GH3 via the p53/p21/RB pathway

Miao Zhang, Xiaowen Bi, Shuai Liu, Yu Liu, Qiyu Wang

TOXICOLOGY. 2023 Apr 13 .

影響因子： 4.571

Heat stress inhibits the proliferation and differentiation of myoblasts and is associated with damage to mitochondria

Jiawei Lu, Huixia Li, Debing Yu, Peng Zhao, Yuan Liu

Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2023 Apr 11 .

影響因子： 6.081

Growth Hormone Promotes Oocyte Maturation In Vitro by Protecting Mitochondrial Function and Reducing Apoptosis

Deng, Ke, Du, Danfeng, Fan, Dengxuan, Pei, Zhenle, Zhang, Shuo, Xu, Congjian

Reproductive Sciences. 2023 Jan 24 .

影響因子： 2.924

Endothelial LRP1-ICD Accelerates Cognition-Associated Alpha-Synuclein Pathology and Neurodegeneration through PARP1 Activation in a Mouse Model of Parkinson’s Disease

Huang, Rui, Gao, Yuyuan, Duan, Qingrui, Zhang, Qingxi, He, Peikun, Chen, Jianing, Ma, Guixian, Wang, Limin, Zhang, Yuhu, Nie, Kun, Wang, Lijuan

MOLECULAR NEUROBIOLOGY. 2022 Nov 17 .

影響因子： 5.682

Curcumin exerts chondroprotective effects against osteoarthritis by promoting AMPK/PINK1/Parkin-mediated mitophagy

Zhuangzhuang Jin, Bohan Chang, Yingliang Wei, Yue Yang, He Zhang, Jiabao Liu, Longhuan Piao, Lunhao Bai

Biomedicine & Pharmacotherapy. 2022 Jul 01 .

影響因子： 7.18

Momordica. charantia-Derived Extracellular Vesicles-Like Nanovesicles Protect Cardiomyocytes Against Radiation Injury via Attenuating DNA Damage and Mitochondria Dysfunction

Wen-Wen Cui, Cong Ye, Kai-Xuan Wang, Xu Yang, Pei-Yan Zhu, Kan Hu, Ting Lan, Lin-Yan Huang, Wan Wang, Bing Gu, Chen Yan, Ping Ma, Su-Hua Qi, Lan Luo

Frontiers in Cardiovascular Medicine. 2022 Apr 18 .

影響因子： 5.846