簡介

哺乳動物細胞產生機械力的能力 推動、拉動或擠壓 是細胞單獨和共同用作組織以執(zhí)行重要生理功能的固有能力。為了更好地理解細胞力產生背后的機制，確定新的藥物靶點或候選藥物，并驗證被認為影響力產生的現(xiàn)有候選藥物，必須采用定量篩選方法對細胞力進行功能評估。

優(yōu)勢

使用帶熒光標記微圖案的 384 孔板篩選大型藥物文庫，以了解其對細胞收縮力的影響

在較長的實驗時間內追蹤每個細胞群中每個細胞的收縮力

使用高通量、全孔成像加速采集

由于功能性細胞輸出驅動了這些疾病，因此測量收縮力生成本身，而不是鈣流等非特異性分子替代物，對于最大限度地提高藥物開發(fā)的成功至關重要。本研究報告了我們開發(fā)的稱為 FLECS（熒光彈性收縮表面）的自動化單細胞功能收縮性測定法，用于評估細胞的張力收縮性和測試化合物調節(jié)細胞施加力的能力。從 6 名致命性
哮喘患者和 6 名非哮喘患者獲得的原代人氣道平滑肌 （HASM） 細胞在收縮張力、對激動劑緩激肽的反應以及最終支氣管擴張劑福莫特羅方面進行了比較。
使用單塊 FLECS 384 孔板評估所有 12 個細胞系的單細胞收縮力，并使用 ImageXpress Micro 4 高內涵成像系統(tǒng)進行成像，該系統(tǒng)能夠在一張4倍放大的圖像中捕獲了384孔板的整個區(qū)域(圖1)。ImageXpress Micro 4系統(tǒng)提供的一致的寬視場成像可以在很長的實驗周期內以4分鐘的間隔跟蹤超過100,000個收縮的單細胞。

圖 1：含有細胞結合熒光微圖案的 FLECS 384 孔板的單孔。

（A） 使用 ImageXpress Micro 4 系統(tǒng)，可以 4X放大采集 384 孔板的整個單孔。（B） 嵌入彈性基底的熒光微圖案（綠色）被單細胞（以紅色染色的肌動蛋白，以藍色染色的細胞核）粘附和擠壓，導致相對于空孔微圖案的規(guī)則和可量化的尺寸變化，與細胞產生的力的大小相對應。

Materials

•       FLECS 檢測試劑盒

•       384 孔 FLECS 板（Forcyte Biotechnologies）

•       Hoechst 33342 細胞核染色劑 （ThermoFisher）

•       原代人氣道平滑肌細胞（6 個健康供體和 6 個哮喘供體）- 由羅格斯大學羅格斯轉化醫(yī)學和科學研究所 Panettieri 實驗室提供

•       化學品

•       醋酸緩激肽 （Millipore Sigma）

•       福莫特羅 （Millipore Sigma）

•       采用 MetaXpress 軟件的 ImageXpress Micro 4 高內涵成像系統(tǒng)（Molecular Devices）

評估12種患者源性HASM細胞的功能收縮性 

FLECS 384 孔板的功能收縮性，這些板包含一系列熒光標記的細胞外基質 （ECM） 微圖案，這些微圖案具有共價嵌入軟基膜中的特定形狀和大小，并接種有待評估的細胞。該研究評估了源自12名患者的 12 株原代 HASM 細胞，其中 6 株為致命性哮喘，6 株為非哮喘，每對為年齡、性別和種族匹配。

將原代 HASM 細胞接種在 384 孔板中，并帶有熒光標記的微圖案。將細胞在 37°C 的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 小時。使細胞粘附在這些模型上，以便應用各種處理。然后，在 37°C 下用 Hoechst 33342 對細胞染色 15 分鐘，以鑒定與微圖案結合的單細胞。細胞收縮在下面的彈性膜上產生機械力，并在圖案周圍產生校準良好的位移。在 ImageXpress Micro 4 系統(tǒng)上使用 4X 物鏡采集細胞結合微圖案的基線圖像（細胞核的 DAPI 和熒光標記的微圖案的FITC）。然后，用激動劑（10 pM 緩激肽）處理細胞，每 4 分鐘對微圖案進行一次成像，持續(xù) 12 分鐘（僅 FITC 通道）。然后，用支氣管擴張劑（50 pM 福莫特羅）或溶媒對照處理細胞，并微圖案每 4 分鐘成像一次，持續(xù) 16 分鐘（僅 FITC 通道）。然后，在 37°C 下孵育平板 10 分鐘，然后獲取最終圖像。按照圖 2 所示的程序測量了基底張力、對緩激肽的收縮反應、對支氣管擴張劑福莫特羅的敏感性以及這些反應的動力學。

圖 2. 將 12 個細胞系接種到 FLECS 384 孔板中的實驗步驟示意圖。

圖 3. 用于處理收縮力數(shù)據(jù)的 Forcyte 算法。 算法 （i） 識別和測量圖像集 1 中的所有微圖案，（ii） 交叉引用圖像集 2 中每個微圖案的位置，以及 （iii） 確定是否存在 0、1 或 >2 個細胞核（即細胞）。將包含單個細胞核（即 1 個細胞）的微圖案的平均中心至末端位移與包含 0 個細胞核（即未占用模式）的所有未位移模式的相應測量值的中位數(shù)進行比較，并將差異繪制為水平直方圖。

識別與微圖案結合的單細胞并計算位移

圖像從 MetaXpress 軟件導出，并使用 Forcyte 算法處理用于收縮力數(shù)據(jù)（圖 3）。根據(jù) Hoechst 染色法鑒定與微圖案結合的單細胞。排除了多個細胞結合的模式。對于由單個單元綁定的每個模式，中心與每個終端之間的平均距離包括一個數(shù)據(jù)點。

疾病細胞與正常細胞的收縮力特征隨時間推移而明顯不同，對 ~31，000 個激動劑反應細胞（來自 12 個細胞系）中的每一種進行追蹤，從而選擇 16 分鐘時收縮增加的細胞進行進一步分析（平均約 72% 的細胞）。我們追蹤了所有選定細胞的收縮分布變化（圖 4A），發(fā)現(xiàn) BK 處理后分布顯示出穩(wěn)健的向上變化，這些變化在添加賦形劑后未減弱，但在福莫特羅處理后停止或逆轉。

在藥物治療過程中追蹤了每個細胞群的中位收縮力值（圖 4B），并觀察到，對于 6 對年齡、種族和性別匹配的伴或不伴致死性哮喘的患者中的 5 對，哮喘患者的細胞表現(xiàn)出更高的色調、更大的 BK 誘導收縮，或兩者兼而有之。在這些病例中，有 4 例的差異具有統(tǒng)計學顯著性（圖 5）。

圖 4. 從微圖案圖像中收集的收縮力數(shù)據(jù)。（A） 單細胞收縮率測定的群體水平直方圖，在使用前收縮激動劑緩激肽以及后來的支氣管擴張劑福莫特羅或溶媒對照（1 名患者）治療后隨時間變化。（B） 所有 12 名患者的群體范圍內直方圖得出的中位值。

圖 5. 年齡、性別和種族匹配的供體細胞的成對比較。

結論

結論

FLECS 孔板產品和 ImageXpress Micro 4 系統(tǒng)提供了一種功能上篩選大型藥物庫的方法，以檢測已知與疾病過程有關的對細胞收縮力的影響。使用 FLECS 孔板檢測單細胞收縮力，其中大量精確形狀的粘合劑和熒光微圖案沉積在標準微孔板底部的彈性膜上，可快速評估原代細胞或細胞系的功能性力生成，這些細胞或細胞系粘附在這些微圖案上，并通過力生成引起尺寸變化。ImageXpress Micro 4 系統(tǒng)可快速（<10 分鐘/整塊 384 孔板）采集整個孔（一個圖像中的完整 384 孔面積），空間分辨率足以觀察細胞收縮力的微小差異?？焖佟⑷壮上袷?/span> FLECS 技術可用于高通量篩選應用以及研究細胞力生成的高分辨和多維實驗。本研究是之前發(fā)表的一項更大研究的一部分1。

參考

1. Pushkarsky， I. 等人 用于高通量單細胞力細胞測定的彈性傳感器表面。Nature Biomedical Engineering 2， 124-137 （2018）。