自噬作為藥物治療的一個(gè)有前景的靶標(biāo)

自噬及其失調(diào)已被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病和癌癥中發(fā)揮著重要作用，因此，在這個(gè)過程中發(fā)現(xiàn)新的治療靶標(biāo)已成為一種有前景的藥物治療方法。自噬是一種在細(xì)胞應(yīng)激下降解和回收受損蛋白和細(xì)胞器的調(diào)控過程1，2。被稱為自噬體的囊泡通過在標(biāo)記為破壞的細(xì)胞成分周圍形成雙膜來進(jìn)行組裝1。自噬體囊泡隨后與溶酶體融合，傳遞其內(nèi)容物以供溶酶體水解酶降解。

自噬具有多種復(fù)雜的生理和病理生理作用，例如適應(yīng)營養(yǎng)饑餓、清除受損的細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器、細(xì)胞發(fā)育、抗老化、消除微生物、細(xì)胞死亡、腫瘤抑制和抗原呈遞2。線粒體分裂是自噬對(duì)線粒體的選擇性降解3。該過程通常可以消除細(xì)胞損傷或應(yīng)激后有缺陷的線粒體。

Materials

•  PC12人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（ATCC）

•  384 孔板（Greiner）

•  CYTO-ID® 自噬檢測(cè)試劑盒（ENZO Life Sciences）

•  橙色線粒體染料

•  Hoechst 33342

•  ImageXpress® Pico自動(dòng)化細(xì)胞成像系統(tǒng)（Molecular Devices）

•  CellReporterXpress 數(shù)據(jù)采集和分析軟件（Molecular Devices）

優(yōu)勢(shì)

定量化合物對(duì)自噬過程的影響

使用核標(biāo)記物分割細(xì)胞，檢測(cè)和表征小的目標(biāo)物

使用自動(dòng)成像確保可靠的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

使用自動(dòng)細(xì)胞成像檢測(cè)和定量自噬體顆粒

評(píng)估對(duì)自噬的影響

這篇應(yīng)用說明中，我們?cè)u(píng)估了ImageXpress Pico自動(dòng)化細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)和定量自噬體顆粒的效率。PC12人神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系被用作檢測(cè)開發(fā)模型。將細(xì)胞以 6，000 個(gè)細(xì)胞/孔接種到384孔板中，孵育48小時(shí)。為了評(píng)估對(duì)自噬的影響，使用不同濃度的氯喹或維拉帕米處理細(xì)胞48小時(shí)。維拉帕米可以誘導(dǎo)自噬，而氯喹可以抑制導(dǎo)致顆粒累積的自噬體降解。化合物處理后，使用CYTO-ID®自噬檢測(cè)試劑盒對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，以示蹤自噬體。此外，我們使用熒光線粒體染料檢測(cè)線粒體，并使用Hoechst識(shí)別細(xì)胞核（濃度分別為 0.2 μM 和 1 μM）。使用搭配20X或40X物鏡的ImageXpress Pico系統(tǒng)以及三個(gè)檢測(cè)通道（FITC、TRITC 和 DAPI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。在 20X物鏡下每個(gè)孔采集一張圖像，在40X物鏡下每個(gè)孔采集2-4張圖像，以確保可靠的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。使用CellReporterXpress圖像采集和分析軟件中的自噬或線粒體應(yīng)用方案分析圖像。

圖 1：自噬體檢測(cè)。上圖顯示了經(jīng)過自噬誘導(dǎo)劑氯喹（30 pM）處理并使用Cyto-ID染料染色的PC12細(xì)胞的代表性自噬細(xì)胞圖像和分析掩膜。在CellReporterXpress軟件中，使用點(diǎn)分割識(shí)別自噬顆粒。細(xì)胞核顯示為藍(lán)色、線粒體顯示為橙色，自噬顯示為綠色。下圖顯示了使用橙色線粒體完整性染料對(duì)未處理細(xì)胞進(jìn)行染色。用于線粒體檢測(cè)的圖像和分析掩膜。。

這些算法可以檢測(cè)和表征小的目標(biāo)物，如細(xì)胞質(zhì)中的自噬體或線粒體，同時(shí)使用核標(biāo)記來分割細(xì)胞。用于檢測(cè)自噬的定量檢測(cè)包括顆?？倲?shù)或平均數(shù)、顆粒（亞細(xì)胞對(duì)象）的總面積或平均面積以及強(qiáng)度。用氯喹（30 μM）處理后細(xì)胞的代表性圖像和分析掩膜如圖1所示。檢測(cè)氯喹和維拉帕米處理后細(xì)胞的濃度反應(yīng)，并評(píng)估EC50值。總自噬體計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)表明，氯喹和維拉帕米處理使細(xì)胞自噬水平分別增加4.6倍和3.3倍（EC50值分別為4.0和3.6 μM）。

結(jié)論

該方法與CYTO-ID染料結(jié)合可用于檢測(cè)自噬顆粒，并可用于檢測(cè)開發(fā)和定量化合物對(duì)自噬過程的影響。

參考文獻(xiàn)

1.       1. Mizushima, N; Komatsu, M (2011). Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147: 728–41

2.       2. Mizushima, N; (2007). Autophagy: process and function, Genes & Dev. 21: 2861-2873