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游離細胞藥物攝取實驗操作說明
閱讀：5961 發(fā)布時間：2017-3-16| 提 供 商 | 上海谷研實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 7.9KB |
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原理和目的
游離細胞攝取實驗以大鼠游離肝細胞、人游離肝細胞應用較為廣泛。肝細胞膜上轉運體主要為有機陰離子轉運多肽(organic anion transporting polypeptides,OATPs)、Na+-?；悄懰峁厕D運多肽( Na+/taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)、有機陰離子轉運體（organicanion transporters, OATS )、有機陽離子轉運體（organic cation transporters, OCTs）等，這些轉運體介導藥物在體內的肝臟分布及膽汁排泄過程。
應用膠原酶灌流法分離大鼠肝細胞并取得有較高活性的游離肝細胞（或者人的肝細胞），考察肝細胞對藥物的攝取動力學特征，求出有關動力學參數(shù)，以研究存在于肝細胞膜上轉運體介導藥物轉運的機制。
本實驗方法的優(yōu)點是可以靈活地控制實驗條件，但是會使游離肝細胞失去了細胞極性（即方向性，如血管側和膽管側）?？梢酝ㄟ^使游離肝細胞與藥物在一定條件下、一定時間接觸后測定肝細胞攝取藥物的經(jīng)時曲線，求出肝清除率，并可定量預測藥物在肝臟的分布及膽汁排泄。
材料
1．大鼠或者人肝細胞混懸液若干。
2．試劑 0.4％錐蟲藍、待測藥物溶液、混合油（礦物油37.4g、硅油6.88g),Krebs-Hens-eleit 液（118mM NaCl，23.8mM NaHC03，4.8mM KCl，1.OmM KH2PO4，1.2mM MgSO4，12.5mM HEPES,5.OmM glucose，and 1.5mM CaCl2，調節(jié)pH 7.4）
3．儀器及試劑凈化工作臺、倒置顯微鏡、恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機、制冰機、液相色譜-質譜聯(lián)用儀。
方法
1．用膠原酶灌流的方法分離肝細胞并取得有較高活性的游離肝細胞置于冰上，在計數(shù)后將其稀釋成2x106/ml的懸濁液。
2．取其一部分放置于37℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱，溫孵3分鐘后，加入等體積待測藥物，在37℃的恒溫振蕩條件下開始進行游離肝細胞對藥物的攝取實驗。
3．按所需時間點取出一定體積（一般為100ul）藥物及肝細胞混合液，加到事先準備的細離心管中（0.45 ml)，離心管上、下層分別放入100ul混合油（礦物油、硅油）和5M醋酸銨溶液（圖11-1）。
4．立即將有混合藥液的細離心管離心，使肝細胞因重力作用從上層藥物的混合液中落入下層的醋酸銨中，從而終止攝取反應的進行。
5．將終止反應后的細離心管放于-20℃保存，在測定前從混合油層將其切開，經(jīng)沉淀蛋白等處理后用LC-MS進行定量測定。
結果與分析
1．確定藥物的線性攝取時間（溫孵時間）根據(jù)LC-MS定量測定結果計算各時間點細胞對藥物的攝取量，作細胞對藥物攝取量隨時間變化曲線，從而確定線性攝取時間（圖11-2）。
2．濃度依賴性攝取 根據(jù)確定的線性攝取時間，分別進行在37℃和4℃下的藥物濃度依賴性攝取實驗，了解藥物的特異性攝?。?7℃）和非特異性攝?。?℃）攝取以及飽和濃度；作細胞對藥物攝取速度隨藥物濃度變化曲線（圖11-3)。
3．細胞攝取藥物動力學參數(shù) 根據(jù)濃度依賴性攝取結果，由Eadie-Hofstee方程以特異性攝取初速度（υ）對初速度與藥物濃度比值（υ/s）計算Km、Vmax,表征藥物攝取的動力學特征（圖11-4)。
注意事項
1．待攝取藥物溶液中若含有DMSO，則其含量不能超過 0.1％～0.5%，因為DMSO可能會影響肝細胞攝取活性。
2．肝細胞活性鑒定用膠原酶灌流法獲取的游離肝細胞，在藥物攝取實驗之前用0.4％錐蟲藍顯微鏡下觀察其活性，活性大于85％可用于攝取實驗。人冷凍肝細胞活性若不符合要求，可經(jīng)離心純化，直到符合要求后再應用。