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基因型

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簡(jiǎn)要說(shuō)明

Origami 2系列菌株是K-12菌株衍生而來(lái)，在thioredoxinreductase (trxB)和glutathione reductase(gor)基因上同時(shí)含有突變，這使得該菌株能夠更加高效的在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生成二硫鍵，有助于含二硫鍵蛋白的活性蛋白形成。與Origami系列菌株相比，Origami 2系列菌株是卡那敏感的，這使得該菌株能夠適用于大多數(shù)的蛋白表達(dá)質(zhì)粒。Gor基因突變使得該菌株和原來(lái)的Origami(DE3)菌株一樣具有四環(huán)素抗性。DE3是溶源性的λDE3,所以在lacUV5啟動(dòng)子下攜帶有T7 RNA聚合酶的染色體拷貝。該菌株適用于pET系列載體，及其他T7啟動(dòng)子系列載體。Origami2 (DE3)同時(shí)還是liang氨酸生長(zhǎng)缺陷型宿主菌,可用于相關(guān)的克隆以及蛋白表達(dá),在IPTG的誘導(dǎo)下可進(jìn)行蛋白表達(dá)。Origami2 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)108cfu/μg。

操作說(shuō)明

1、取100μl冰上融化的Origami2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2mM均可）。

5.為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。