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液滴微流控（八）：如何保證液滴的穩(wěn)定性？
液滴，因其微型化及高通量的特性，已成為一種用于微生物培養(yǎng)的有力工具，但在液滴中進(jìn)行微生物的長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，微生物的生長(zhǎng)（生長(zhǎng)速度及形態(tài)）及其分泌的各種代謝物，均會(huì)對(duì)液滴的穩(wěn)定性造成一定的影響，可能會(huì)出現(xiàn)液滴“破裂”或者液滴互相融合現(xiàn)象，此外，部分微生物的生長(zhǎng)對(duì)微環(huán)境特別敏感，液滴失去穩(wěn)定性，便意味著我們很有可能獲取到不準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，在液滴制備中，我們需要對(duì)液滴進(jìn)行“加固”，常見的一種辦法是加入表面活性劑，一方面它對(duì)多種微生物的具有良好生物相容性，另一方面它能為液滴提供良好的穩(wěn)定性。
本文通過對(duì)比3種不同濃度下的3類表面活性劑的液滴細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以液滴穩(wěn)定性和液滴包裹率來評(píng)估3種表面活性劑的性能。
試劑與方法
在Novec HFE7500電子氟化液（3M）中加入dSurf表面活性劑（記為實(shí)驗(yàn)組1）和另外兩種市場(chǎng)已有表面活性劑（分別記為對(duì)比組1和對(duì)比組2），以作為液滴中的連續(xù)相（油相），所加入表面活性劑濃度分別為0.5%、2%和5%（w/w）。
實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)述：從健康志愿者皮膚上采集微生物群落（非單一菌株），以用于制備液滴，使用壓力泵（Fluigent，Flow EZ）作為壓力源，在PDMS液滴芯片上，以7-10kHz的速率，生成體積為20pl的液滴，并將液滴收集在37℃的容器中進(jìn)行孵育，不直接暴露在空氣中。在孵育時(shí)間的第0、1、3和7天時(shí)，取顯微鏡下的液滴成像圖片，以進(jìn)行液滴觀察。
液滴穩(wěn)定性對(duì)比
在液滴剛開始生成時(shí)，3種不同濃度的表面活性劑均能立即穩(wěn)定液滴，看不出差異。
上圖中，左、中、右三圖分別為使用實(shí)驗(yàn)組1、對(duì)比組1和對(duì)比組2三種表面活性劑的液滴生成圖。A、B、C分別表示表面活性劑的濃度為0.5%、2%和5%。
在對(duì)微生物培養(yǎng)的第0，1，3和7天，觀察使用3種表面活性劑在不同濃度下所制備的液滴，獲取數(shù)據(jù)見下。
1.下圖為實(shí)驗(yàn)組1的液滴孵育狀況：在表面活性劑濃度為0.5%時(shí)，1天后，便可觀察到液滴存在融合“變大”的跡象，而在濃度為2%和5%時(shí)，培養(yǎng)7天后，液滴大小依舊保持均一，部分液滴顏色加深（微生物培養(yǎng)成功），表明液滴穩(wěn)定性良好。
2.下圖為對(duì)比組1的液滴孵育狀況：在表面活性劑濃度為0.5%時(shí)，液滴的融合“變大”情況比較明顯；當(dāng)濃度為2%時(shí)，能觀察到部分液滴的融合“變大”；當(dāng)濃度為5%時(shí)，培養(yǎng)7天后，液滴大小均一，部分液滴顏色加深（微生物培養(yǎng)成功），表明液滴穩(wěn)定性良好。
3.下圖為對(duì)比組2的液滴孵育狀況：在濃度為0.5%時(shí)，明顯可觀察到液滴的融合“變大”現(xiàn)象；當(dāng)濃度為2%時(shí)，僅出現(xiàn)少量液滴融合“變大”現(xiàn)象；當(dāng)濃度為5%時(shí)，7天培養(yǎng)中，液滴大小均一，部分液滴顏色加深（微生物培養(yǎng)成功），表明液滴穩(wěn)定性良好。
液滴包裹率對(duì)比
對(duì)液滴中微生物培養(yǎng)1天后，開始觀察液滴中的微生物情況，將含有3個(gè)以上細(xì)胞的液滴記做“已包裹液滴”，每次分析至少分析1000個(gè)液滴，將得到的液滴包裹率數(shù)據(jù)整理為下圖。
上圖中，可觀察到使用dSruf表面活性劑制備的液滴，液滴包裹率高，在對(duì)液滴中微生物培養(yǎng)7天后，包裹率仍在30%以上。對(duì)比組1包裹率低，尤其當(dāng)對(duì)比組1中所用表面活性劑濃度為0.5%時(shí)，液滴乳化失敗，微生物培養(yǎng)失敗，包裹率為0。
結(jié)論
油包水型液滴中，水相中的疏水化合物及微生物的生長(zhǎng)，正是液滴微生物培養(yǎng)所面臨的挑戰(zhàn)，使用表面活性劑，可明顯增強(qiáng)液滴穩(wěn)定性。
本文數(shù)據(jù)表明，dSurf表面活性劑在液滴穩(wěn)定性上略勝*，其2%濃度的效果相當(dāng)于對(duì)比組5%的效果，同時(shí)使用dSurf時(shí)，細(xì)胞包裹率高，這可能意味著dSurf具有更好的生物相容性。