側(cè)流免疫層析（lateral flow immunochromatography assay，LFIA；也簡稱為側(cè)向?qū)游觯┦且环N基于抗原、抗體免疫反應(yīng)的經(jīng)典床旁檢測技術(shù)（point of care testing，POCT）。側(cè)流免疫層析試紙條，是一種在不使用實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的情況下確認(rèn)目標(biāo)分析物是否存在的簡易便攜裝置，作為是一種低成本、直接的方法，被廣泛應(yīng)用于檢測人類和動(dòng)物的感染或生物標(biāo)志物，以及水、食物和動(dòng)物飼料中的污染物和有害物質(zhì)。

側(cè)流免疫層析常見形式

側(cè)流免疫層析的3種常見形式：直接法（圖1）、夾心法（圖2）和競爭法（圖3）。每個(gè)測試都是以線性條帶形式運(yùn)行的，由分離和檢測感興趣的分析物所需的材料制成，并提供一個(gè)對照反應(yīng)以確認(rèn)測試的正確進(jìn)行。下面的例子概述了側(cè)流免疫層析的基本原理，并簡要地強(qiáng)調(diào)了條帶的組成部分和它們的功能。

關(guān)鍵試劑

抗體 - 親和力和特異性

選擇正確的抗體是開發(fā)成功的側(cè)向流動(dòng)免疫測定法的關(guān)鍵因素。

“如果沒有認(rèn)真測試篩選合適的抗體，那么再多的優(yōu)化都無法克服這種固有的缺陷"（Brown，2008 年）

親和力

親和力特別重要，因?yàn)榭乖南鄬ωS度可能很低。由于抗原、抗體偶聯(lián)物和包被的抗體在測試條的分析區(qū)域中相互作用僅幾秒鐘，因此需要快速的 kon速率和慢的 koff速率。

特異性

抗體必須能特異性地識(shí)別目標(biāo)抗原，而不能檢測類似或同源的蛋白質(zhì)和分子。由于在LFIA測試中使用了高濃度的抗體（通常比ELISA板孔中的抗體濃度高25-100倍），出色的特異性也是至關(guān)重要的。膠體金抗體偶聯(lián)物通常以每次30-250ng的量被使用。如果假設(shè)樣品在10-50ul內(nèi)使標(biāo)記的抗體再水化，那么抗體結(jié)合物的濃度將在0.6到20ug/ml之間。在較高的濃度下，抗體可能是其Kd的100倍，這可能會(huì)促使結(jié)合力弱、特異性低的抗體產(chǎn)生非特異性的相互作用，從而導(dǎo)致假陽性。

數(shù)量

首先要考慮的因素之一是啟動(dòng)和維持商業(yè)產(chǎn)品所需的數(shù)量。如果每條帶 1ug 的捕獲抗體并希望制作 100 萬條，則所需的抗體量至少為 1g。因此，確保供應(yīng)商能夠以一致的質(zhì)量生產(chǎn)大批量產(chǎn)品至關(guān)重要。如果要在內(nèi)部制造抗體，則必須注意選擇合適的抗原、免疫方法、篩選策略和放大工藝。

克隆性

單克隆抗體

單克隆抗體 (MAb) 的開發(fā)和生產(chǎn)是獲得具有所需屬性和保證質(zhì)量穩(wěn)定的抗體的有效方法。然而，在體外條件下的放大可能會(huì)很昂貴，并且在純化運(yùn)行之間可能會(huì)出現(xiàn)批次間的差異。篩選單克隆抗體以識(shí)別那些在膜結(jié)合、標(biāo)記和與最終測定中使用的其他抗體一起表現(xiàn)良好的單克隆抗體也很重要?？贵w在與膜結(jié)合時(shí)作為捕獲劑工作良好，但在與報(bào)告分子結(jié)合時(shí)表現(xiàn)不佳的情況并不少見。最后，篩選還必須識(shí)別在實(shí)驗(yàn)條件下識(shí)別檢測形式中表位的抗體，例如緩沖液成分或抗原的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。

多克隆抗體

多克隆抗體 (PAb) 的生產(chǎn)很容易擴(kuò)大規(guī)模，無論是使用兔子、山羊、雞還是驢作為宿主動(dòng)物。PAb 的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們也可用于實(shí)現(xiàn)更高的檢測靈敏度。作為IgG的混合物，每種IgG同時(shí)和組合識(shí)別抗原上的不同表位，它們允許沉積更多的報(bào)告分子，從而增加信號(hào)。PAb 可能存在批次間差異，但由于它們是由宿主動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的，可能會(huì)隨著時(shí)間而改變。

驗(yàn)證

無論來源或制造方法如何，都需要使用相應(yīng)的工作流程來檢驗(yàn)，以確保測試的一致性和可重復(fù)性。

對照線/質(zhì)控線—抗體（Control Reagents）

雖然開發(fā)或選擇合適的捕獲和檢測抗體對檢測的性能至關(guān)重要，但在LFIA中使用的控制試劑的選擇也很重要。與報(bào)告分子偶聯(lián)的IgG或二抗通常被用來設(shè)置必要的對照線/質(zhì)控線，以確保測試的正確可信。例如，陽性對照線可以用抗雞的二級(jí)抗體，該抗體與偶聯(lián)的雞IgY結(jié)合。雞IgY經(jīng)常被使用，因?yàn)榕c哺乳動(dòng)物IgG相比，雞IgG的同源性和序列特征較低，因此產(chǎn)生的非特異性相互作用較少。對照線抗體也應(yīng)該與LFIA中使用的其他抗體有最小的交叉反應(yīng)，因?yàn)槿绻麥y試中使用的IgG或樣品中存在的IgG干擾了對照試劑的結(jié)合，那么對照線的強(qiáng)度就會(huì)有很大的變化。

用于血清學(xué)測試的捕獲抗體和檢測抗體

血清學(xué)LFIA，使用抗體來捕獲或檢測由患者免疫反應(yīng)產(chǎn)生的IgG。在血清學(xué)LFIAs中，檢測線是涂有抗原的，而病人的樣本中含有特定同型的抗原IgG，通過與病人血液中的IgG結(jié)合，而產(chǎn)生信號(hào)，該抗體與檢測線上的抗原相結(jié)合（見圖1）。檢測抗體的特異性很關(guān)鍵，它不應(yīng)該與檢測中使用的其他物種的抗體或其他同種型的抗體結(jié)合。例如，在獨(dú)立檢測IgG和IgM同種型的檢測中，抗IgG抗體不能與IgM發(fā)生交叉反應(yīng)，而抗IgM抗體不能檢測IgG。

報(bào)告分子與偶聯(lián)物

常用于側(cè)流免疫層析的報(bào)告分子包括膠體金、乳膠珠和熒光染料。每種選擇都有明顯的優(yōu)勢，選擇取決于檢測目標(biāo)和檢測讀出方法。其他標(biāo)簽包括順磁顆粒、酶、量子點(diǎn)、纖維素納米珠、納米金、二氧化硅納米顆粒、生物發(fā)光和發(fā)光材料，以及上轉(zhuǎn)換熒光劑（Goryacheva等，2013，Quesada-González & Merko?i，2015，和（Guo等，2021）

膠體金（Colloidal Gold）

膠體金是一種廣泛用于LFIA的偶聯(lián)物，因?yàn)樗墚a(chǎn)生強(qiáng)烈的顏色，易于偶聯(lián)，并且它的質(zhì)量穩(wěn)定。典型的尺寸在40-80nm之間，其中40nm是最常見的。

金顆粒與抗體的結(jié)合通常是通過靜電和疏水的相互作用被動(dòng)進(jìn)行的。這兩個(gè)實(shí)體在低離子強(qiáng)度的緩沖液中混合，然后用多元醇或蛋白質(zhì)如白蛋白或酪蛋白進(jìn)行封閉。膠體金也有活化的表面，如羧基，允許在必要時(shí)進(jìn)行共價(jià)連接。

乳膠微粒

乳膠顆粒用途廣泛，自其最初開發(fā)以來一直被用于側(cè)向流檢測。顆?？梢匝b載彩色和/或熒光染料、順磁顆粒和其他化學(xué)品。不同顏色的染料可以進(jìn)行多種同時(shí)讀出的檢測。用于LFIA的標(biāo)準(zhǔn)尺寸范圍為100-300um。綴合方法在吸附或共價(jià)連接之間變化，取決于表面化學(xué)。乳膠珠的敏感度可能低于膠體金，因?yàn)樗鼈兊拇蟪叽缡顾鼈儾荒苊芗匕b在測試或控制線上。

熒光染料

熒光染料作為標(biāo)簽得到了青睞；作為小分子（<1nm），它們比較大的納米顆粒更容易從偶聯(lián)墊中釋放出來。染料有助于通過一個(gè)LFIA設(shè)備對多種分析物進(jìn)行定量和檢測（Wild，2016），盡管它們需要使用特殊的閱讀設(shè)備來顯示結(jié)果并充分利用染料的特性。適用于LFIAs的熒光團(tuán)應(yīng)該是經(jīng)濟(jì)的，具有長斯托克斯位移，良好的量子產(chǎn)率，并且是光穩(wěn)定的。染料有多種形式，便于與蛋白質(zhì)和小分子上的伯胺和巰基共價(jià)偶聯(lián)。熒光素Fluorescein 和Cyanine染料是流行的選擇。

一些染料可能不適合用于LFIA，因?yàn)樵诟邼舛认聲?huì)出現(xiàn)光漂白或淬滅。結(jié)合活性可能會(huì)因?yàn)榘l(fā)生在抗體副體或目標(biāo)表位的關(guān)鍵點(diǎn)上的共價(jià)偶聯(lián)而受到影響，或者因?yàn)槭杷匀玖弦鸬木奂?/span>

以上，是艾美捷總結(jié)的一些關(guān)于側(cè)流免疫層析（試紙條）親和純化IgG抗體的相關(guān)資料。