人拓?fù)洚悩?gòu)酶II檢測試劑盒旨在檢測任何II型拓?fù)洚惍悩?gòu)酶，無論是真核還是原核。具體來說，我們的Top2測定有助于II型酶的純化和表征，并含有II型拓?fù)洚悩?gòu)酶常規(guī)測定所需的所有試劑。該測定基于動(dòng)基質(zhì)DNA（kDNA）的脫觸手，由于它對(duì)II型活性（不是I型）具有特異性，因此可以用粗細(xì)胞提取物進(jìn)行。使用TopoGEN開發(fā)的新型凝膠系統(tǒng)分解反應(yīng)產(chǎn)物，該系統(tǒng)可以極其快速和明確地檢測拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。包括適當(dāng)?shù)木彌_液、DNA底物和DNA標(biāo)記。Human Top2a包含在目錄號(hào)中用-A表示的試劑盒中。包括拓?fù)洚悩?gòu)酶II脫乙酰化和線性DNA標(biāo)記，以便清楚、容易地鑒定用戶定義的提取物或組分中的拓?fù)洚惷?span style="font-family: Calibri;">II活性。該檢測試劑盒還可以與純化的酶（由TopoGEN提供）結(jié)合使用，以檢測topo II的抑制劑。kDNA測定將檢測刺激拓?fù)洚悩?gòu)酶II切割DNA的毒物以及簡單抑制催化活性的試劑?；?span style="font-family: Calibri;">kDNA的測定的優(yōu)點(diǎn)是，該測定快速且容易，可以從粗混合物或提取物中以活性為導(dǎo)向純化抑制劑。

TopoGEN 拓?fù)洚悩?gòu)酶II檢測試劑盒旨在快速、特異地檢測任何II型拓?fù)洚悩?gòu)酶，無論是真核還是原核。該試劑盒有助于II型酶的純化和表征，并含有拓?fù)洚悩?gòu)酶II常規(guī)檢測所需的所有試劑。

艾美捷TopoGEN拓?fù)洚悩?gòu)酶II檢測試劑盒（20微克kDNA）：

編號(hào)：TG1001

分類：拓?fù)湓噭┖?/span>

標(biāo)簽：人類拓?fù)洚悩?gòu)酶2，top2a，拓?fù)洚悩?gòu)酶2，拓?fù)洚悩?gòu)酶2測定，拓?fù)洚悩?gòu)酶2測定試劑盒

該試劑盒在環(huán)境溫度下運(yùn)輸，如果與酶一起購買，則在干冰上運(yùn)輸。將酶儲(chǔ)存在-70°C。DNA應(yīng)儲(chǔ)存在4°C。收到分析緩沖液成分后，應(yīng)儲(chǔ)存在-20°C。

人類拓?fù)洚悩?gòu)酶II測定試劑盒內(nèi)容（適用于100次測定試劑盒規(guī)格）

100單位人類Top2a酶（可使用目錄編號(hào)TG1001-1A獲?。?/span>

20微克的Kinetoplast DNA (kDNA)

線性kDNA標(biāo)記在凝膠加載緩沖液中

解鏈kDNA標(biāo)記（經(jīng)拓?fù)洚悩?gòu)酶II處理）

10倍拓?fù)洚悩?gòu)酶II測定緩沖液*

5倍停止緩沖液/凝膠加載染料

詳細(xì)說明書

*為了提高穩(wěn)定性，10倍拓?fù)洚悩?gòu)酶II測定緩沖液提供為兩個(gè)組分：緩沖液A（不含ATP）和緩沖液B（含ATP）。每次通過混合緩沖液A和B新鮮配制完整的10倍測定緩沖液。

使用人類拓?fù)洚悩?gòu)酶II測定試劑盒進(jìn)行拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性滴定：

人類拓?fù)洚悩?gòu)酶II測定

第1道：200納克線性化kDNA

第2道：200納克解鏈kDNA

第3道：無拓?fù)洚悩?gòu)酶II

第4道：1:2稀釋的拓?fù)洚悩?gòu)酶II

第5道：1:4稀釋的拓?fù)洚悩?gòu)酶II

第6道：1:8稀釋的拓?fù)洚悩?gòu)酶II

第7道：1:16稀釋的拓?fù)洚悩?gòu)酶II

第8道：1:32稀釋的拓?fù)洚悩?gòu)酶II

第9道：1:64稀釋的拓?fù)洚悩?gòu)酶II

人類拓?fù)洚悩?gòu)酶II酶與kDNA在37°C下孵育15分鐘，使用試劑盒提供的測定緩沖液。酶濃度大約為每微升2單位。反應(yīng)用停止緩沖液終止，并直接加載到含有乙酰胺（0.5微克/毫升）的1%瓊脂糖凝膠上。電泳后，凝膠脫色30分鐘并拍照。請(qǐng)注意，解鏈產(chǎn)物包含開放環(huán)（上帶）和共價(jià)閉合環(huán)（松弛）小環(huán)DNA。還要注意，線性DNA在斷裂和松弛物種之間遷移。所有kDNA制備中都存在斷裂的小環(huán)DNA。此外，不同kDNA制備中斷裂DNA的數(shù)量可能有所不同。試劑盒中提供線性和解鏈kDNA標(biāo)記。運(yùn)行這些標(biāo)記以識(shí)別不同形態(tài)的位置非常重要。當(dāng)測定粗提物時(shí)，還需要注意提取物通?？赡芎凶贤饩€熒光污染物（例如RNA或DNA分解產(chǎn)物）。這些標(biāo)記將有助于識(shí)別此類偽影；然而，我們也建議您運(yùn)行一條不含kDNA底物的蛋白提取物，以揭示這些污染物。

并發(fā)癥：

最嚴(yán)重的并發(fā)癥出現(xiàn)在被測定的提取物中存在干擾蛋白或物質(zhì)時(shí)。粗提物、無細(xì)胞提取物可能含有過量的DNA結(jié)合蛋白或正電荷蛋白，它們粘附在DNA上并抑制酶的接觸。此外，核酸酶污染物可能會(huì)降解或切割kDNA底物，因此模糊結(jié)果。處理這個(gè)問題的一個(gè)好方法包括通過硫酸銨沉淀和柱層析來清理粗提物。此外，通過稀釋提取物和/或添加tRNA載體（以競爭基本蛋白），有時(shí)可以最小化此類問題。

TopoGEN拓?fù)洚悩?gòu)酶II檢測試劑盒文獻(xiàn)參考：

Huimin Zhang, Yun Xiong, Yilun Sun, Jeong-Min Park, Dan Su, Xu Feng, Sarah Keast, Mengfan Tang, Min Huang, Chao Wang, Mrinal Srivastava, Chang Yang, Dandan Zhu, Zhen Chen, Siting Li, Ling Yin, Yves Pommier, Junjie Chen: RAD54L2-mediated DNA damage avoidance pathway specifically preserves genome integrity in response to topoisomerase 2 poisons. Science Advances 9 (49), eadi6681.

Aruna S Jaiswal, Arijit Dutta, Gayathri Srinivasan, Yaxia Yuan, Daohong Zhou, Montaser Shaheen, Doraid T Sadideen, Austin Kirby, Elizabeth A Williamson, Yogesh K Gupta, Shaun K Olsen, Mingjiang Xu, Eva Loranc, Pramiti Mukhopadhyay, Alexander Pertsemlidis, Alexander J R Bishop, Patrick Sung, Jac A Nickoloff, Robert Hromas: TATDN2 resolution of R-loops is required for survival of BRCA1-mutant cancer cells. Nucleic Acids Research, gkad952,

Gardner L, Malik R, Shimizu Y, Mullins N, Elshamy WM: Geminin overexpression prevents the completion of topoisomerase IIα chromosome decatenation, leading to aneuploidy in human mammary epithelial cells.  Breast Cancer Research 2011, 13(3): R53.  doi: 10.1186/bcr2884

Bower J, Karaca GF, Zhou Y, Simpson DA, Cordeiro-Stone M, Kaufman WK: Topoisomerase IIa maintains genomic stability through decatenation G2 checkpoint signaling.  Oncogene 2010, 29(34): 4787-4799.  doi: 10.1038/onc.2010.232

Polycarpou-Schwarz M, Müller K, Denger S, Riddell A, Lewis J, Gannon F, Reid G: Thanatop: A Novel 5-Nitrofuran that is a highly active, cell-permeable inhibitor of topoisomerase II.  Cancer Research 2007, 67: 4451-4458.  doi: 10.1158/0008-5472.CAN-07-0393

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