測量IGFBP-3

目前所有的IGFBP-3免疫分析法都使用特定的抗IGFBP-3抗體的結合來產生信號，從而實現(xiàn)IGFBP-3的定量。在這個系統(tǒng)中，無法避免區(qū)分完整的IGFBP-3分子和它們各自的片段（由于不同蛋白酶活性生理性地產生）。因為一個IGFBP-3分子可以被切割成幾個片段，所以經(jīng)常測量到虛假的高定量值。基于這種方法，無法區(qū)分高IGFBP-3水平或高度片段化。嘗試使用只由完整的IGFBP-3分子表示的結合區(qū)域的單克隆抗體是間接的、不精確的和不充分的，因為所有有效的蛋白酶的活動（它們有不同的作用位點，因此產生不同類型的片段）會被忽視。

然而，IGFBP-3（生物活性）ELISA能夠確定功能性和生物活性的IGFBP-3；功能性是指與主要天然配體，即IGF-I的結合能力。新的測試原理（z利申請中DE19719001）使用固定在微孔板上的抗IGFBP-3抗體和生物s標記的IGF-I作為配體。樣本中的IGFBP-3與微孔板結合，并且當同時被IGFBP-3結合時，生物s標記的IGF-I提供了測試的特定信號。因此，只有功能性IGFBP-3被定量。z利的測試格式確保了在簡單的格式中的可靠性能，就像傳統(tǒng)的ELISA試劑盒一樣。先進且耗時和勞動密集型的生化分析（例如，通過尺寸色譜或西方印跡等）已經(jīng)變得多余，這些分析方法也只能估計濃度。

該酶免疫測定試劑盒用于研究，可定量人血清、肝素血漿或腦脊液中的生物活性IGFBP-3。僅供研究使用。不用于診斷程序。

作為ALPCO在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強烈推薦ALPCO熱銷產品IGFBP-3(生物活性)ELISA試劑盒。產品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

IGFBP-3(生物活性)ELISA試劑盒檢測原理：

IGFBP-3（生物活性）ELISA利用固定在微孔板上的特異性和高親和力的IGFBP-3抗體。配體，生物s標記的IGF-I預先以過量的方式分裝在所需的孔中。樣本用特殊的稀釋液（樣本緩沖液PP）稀釋，從而釋放所有自然結合的IGFs從其結合蛋白上。通過向含有配體的孔中加入含有游離IGFBP-3的稀釋樣本的等分，生物s標記的IGF-I占據(jù)了IGFBP-3的所有現(xiàn)有特定結合位點。通過使用鏈霉親和素-過氧化物酶（POD）綴合物，只有IGFBP-3/生物s標記IGF-I的復合物參與信號產生（通過POD底物反應），因此，只有功能性IGFBP-3被定量。標準品由天然和功能性的人類IGFBP-3制成，濃度分別為0.4、2、6、15和30 ng/mL。

測定程序注意事項：所有測定（標準品、對照血清和樣本）應以雙份進行。為了獲得最佳結果，建議準確移液并嚴格遵守操作規(guī)程。在進行測定時，應盡可能快地移液標準品、對照血清和樣本（例如，<15分鐘）。為了避免由于孵育時間差異導致的變異，酶結合物、底物溶液S以及終止液SL應分別按照相同的順序和時間間隔添加到板中。

1) 請將配體結合物LK用稀釋液VP稀釋1:101（如果需要使用整個微孔板，可能需要4.8 mL，因此將60 ?L濃縮的LK與6 mL緩沖液VP稀釋）。

2) 向每個孔中加入50 ?L已經(jīng)稀釋1:101的配體結合物LK。

3) 在A1/2位置（=空白孔）中加入50 ?L樣本緩沖液PP。

4) 分別向B1/2位置中加入50 ?L標準品A（0.4ng/mL），向C1/2位置中加入50 ?L標準品B（2 ng/mL），向D1/2位置中加入50 ?L標準品C（6 ng/mL），向E1/2位置中加入50 ?L標準品D（15 ng/mL），向F1/2位置中加入50 ?L標準品E（30 ng/mL）。為了控制測試的正確執(zhí)行，可以在G1/2和H1/2位置中分別加入50 ?L稀釋的對照血清KS1和KS2（通常在樣本緩沖液PP中稀釋1:505）。

根據(jù)要求，在其余孔中分別加入50 ?L稀釋后的樣本（通常在樣本緩沖液PP中稀釋1:505）。請在樣本加入后立即混合稀釋液，并在60分鐘內使用。

5) 用密封膠帶覆蓋孔，并在室溫下孵育板2小時（350 rpm振蕩）。

6) 孵育后，吸去孔內的內容物，并用300 ?L洗滌液WP洗滌孔5次。

7) 在最后一次洗滌步驟后，向每個孔中加入100 ?L已經(jīng)稀釋1:101的酶結合物EK（如果需要使用整個微孔板，可能需要9.6 mL，因此可以將120 ?L濃縮的EK與12 mL緩沖液VP稀釋）。

8) 用密封膠帶覆蓋孔，并在室溫下孵育1小時（350 rpm振蕩）。

9) 孵育后，按照步驟6的描述，用洗滌液WP洗滌孔5次。

10) 向每個孔中加入100 ?L TMB底物溶液S。

11) 在室溫下黑暗中孵育板30分鐘。

12) 孵育后，向每個孔中加入100 ?L終止液SL。

13) 在30分鐘內測量450 nm處的吸光度（參考濾光片≥ 590 nm）。

文獻參考：

1) Ballard J, Baxter R, Binoux M, Clemmons D, Drop S, Hall K, Hintz R, Rechler M, Rutanen E, Schwander J(1989) On the nomenclature of the IGF binding proteins. Acta Endocrinol (Copenh) 121:751-752

2) Wilson EM, Oh Y, Rosenfeld RG (1997) Generation and characterization of an IGFBP-7 antibody:Identification of 31 kD IGFBP-7 in human biological fluids and Hs578T human breast cancer conditionedmedia. J Clin Endocrinol Metab Vol 82, 4:1301-1303

3) Baxter RC (1988) Characterization of the acid-labile subunit of the growth hormone-dependent insulin-likegrowth factor binding protein complex. J Clin Endocrinol Metab 67:265-272

4) Baxter RC, Martin JL (1989) Structure of the Mr 140,000 growth hormone dependent insulin-like growthfactor binding protein complex: determinati-on by reconstitution and affinity-labeling. Proc Natl Acad Sci USA86:6898-6902

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