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冷凍細(xì)胞凍結(jié)操作步驟
閱讀:344 發(fā)布時(shí)間:2022-1-11冷凍細(xì)胞凍結(jié)程序:
1. 根據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單zhi定之基礎(chǔ)培育基種類(lèi)、血清種類(lèi)和其它zhi定之成份和份額,制備培育基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法當(dāng)即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培育基或不同之血清種類(lèi),若因試驗(yàn)需要,有必要有所不同時(shí),必須以緩慢份額漸次改變培育基組成,確定細(xì)胞適應(yīng)后,方進(jìn)行所需之試驗(yàn)。
2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清),對(duì)細(xì)胞而言差異極大,請(qǐng)必須根據(jù)細(xì)胞株資料單zhi定之血清種類(lèi)培育之。
3. 將培育基置于37 °C 水槽中回溫,回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之,移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管,當(dāng)即放入37 °C 水槽中快速凍結(jié),水面高度不行接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿,否則易產(chǎn)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)悉數(shù)融化后,以70%ethanol擦拭冷凍管外部,移入無(wú)菌操作臺(tái)。
4. 根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)和濃度,于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取10 ml培育基加至T25 或T75 flask中。取出已凍結(jié)之細(xì)胞懸浮液,慢慢參加T25或T75 flask 內(nèi)之培育基,混合均勻,放入37 °C,5 % CO2培育箱培育。
5. 對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言,1 % 以下之冷凍保護(hù)劑DMSO,不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響,不需馬上由凍結(jié).細(xì)胞中去除,待第二天確定細(xì)胞成長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。
針對(duì)極少數(shù)因?qū)MSO 靈敏或會(huì)形成細(xì)胞分化之細(xì)胞,需當(dāng)即去除DMSO 者,則可將凍結(jié)后之細(xì)胞懸浮液放入5 - 10 ml 培育基中,離心300 xg (約1000 rpm),5 分鐘,小心移去上清液,參加適量新鮮培育基,將細(xì)胞均勻混合后,轉(zhuǎn)移至培育瓶中,再放入37 °C,5 % CO2 培育箱培育。